Imunoloģiskie pētījumi uroloģijā

Imunogrammas nozīmēšana uroloģiskam pacientam nozīmē, ka ārstējošais ārsts aizdomas par imūnsistēmas traucējumiem. Atkārtotas bakteriālas, vīrusu, sēnīšu infekcijas, alerģiskas izpausmes, sistēmiskas slimības var būt šo traucējumu pazīmes, kurām raksturīgi vairāki sindromi (infekciozais, onkoloģiskais, alerģiskais, autoimūnais, limfoproliferatīvais). Vienam pacientam var būt vairāki sindromi. Piemēram, hroniskas infekcijas slimības (infekciozais sindroms) var izraisīt imūndeficītu, un imūndeficīts var izpausties kā nosliece uz infekcijas un onkoloģiskām slimībām (onkoloģiskais sindroms). Nosliece uz infekcijām var rasties sekundāra imūndeficīta fonā, kas attīstījies limfoproliferatīvas slimības, piemēram, leikēmijas, rezultātā. Ir trīs galvenās patoloģisko izmaiņu grupas imūnsistēmā:

• imūnsistēmas vienas vai otras saites kvantitatīvs vai funkcionāls deficīts, kas noved pie imūndeficīta stāvokļa attīstības;
• imūnsistēmas antigēnu atpazīšanas traucējumi, kas izraisa autoimūnu procesu attīstību;
• hiperreaktīva vai "perversa" imūnreakcija, kas izpaužas kā alerģisku slimību attīstība.

Ir skrīninga (1. līmeņa testi) un precizējošās (2. līmeņa testi) imunodiagnostikas metodes. Pirmās paredzētas imūnsistēmas traucējumu reģistrēšanai, otrās - lai noteiktu mehānismus, kas iesaistīti to īstenošanā, lai veiktu turpmāku imunokorekcijas metodi.

B šūnu imunitāte

Skrīninga metodes

• B limfocītu relatīvā un absolūtā skaita noteikšana, izmantojot imunofluorescenci vai plūsmas citofluorometriju ar monoklonālām antivielām pret B šūnu antigēniem (CD19, CD20, kur CD ir diferenciācijas klasteri). Normāls B limfocītu saturs pieaugušajiem ir 8–19% no kopējā leikocītu skaita jeb 190–380 šūnas/μl. B limfocītu satura palielināšanās notiek akūtu un hronisku bakteriālu un sēnīšu infekciju, hronisku aknu slimību, sistēmisku saistaudu slimību, hroniskas limfoleikozes un mielomas gadījumā.
• Nespecifisko imūnglobulīnu (F, M, G, E) koncentrācijas noteikšana ar vienkāršu radiālu imunodifūziju, nefelometriju vai turbometriju, radioimunoanalīzi vai enzīmu imūnanalīzi (ELISA). Normas pieaugušajiem: imūnglobulīns (Ig) A 0,9–4,5 g/l. IgM 03–3,7 g/l. IgG 8,0–17 g/l. Imūnglobulīnu koncentrācijas palielināšanās notiek tajos pašos patoloģiskajos apstākļos, kuros palielinās B limfocītu saturs. Imūnglobulīnu koncentrācijas samazināšanās notiek iedzimtas hipogammaglobulinēmijas, imūnsistēmas audzēju, liesas izņemšanas, olbaltumvielu zuduma, nieru vai zarnu slimību, ārstēšanas ar citostatiskiem līdzekļiem un imūnsupresantiem gadījumā.

Precizējošas metodes

• Asinīs cirkulējošo imūnkompleksu noteikšana, selektīvi nogulsnējot polietilēnglikolā, kam seko spektrofotometriskā blīvuma pārbaude (norma 80–20 U). Cirkulējošo imūnkompleksu palielināšanās ir raksturīga akūtām bakteriālām, sēnīšu, vīrusu infekcijām, autoimūnām, imūnkompleksu slimībām, seruma slimībai, 3. tipa alerģiskām reakcijām;
• Specifisku imūnglobulīnu noteikšana asinīs attiecībā uz baktēriju un vīrusu antigēniem, dezoksiribonukleīnskābi (DNS) autoimūnās slimībās, antispermas (autoimūna neauglība) un antirenalu antivielu (pielonefrīts un glomerulonefrīts) noteikšana ar radiālās imunodifūzijas vai ELISA metodi.
• Antispermas antivielu noteikšana spermā [MAR tests (jaukta antiglobulīna reakcija)], normāls - negatīvs rezultāts.
• Imūnglobulīnu koncentrācijas noteikšana urīnā, lai veiktu diferenciāldiagnozi starp pielonefrītu un glomerulonefrītu (proteinūrijas selektivitāte).
• IgE satura noteikšana prostatas sulā alerģiska prostatīta diagnosticēšanai, izmantojot radiālās imunodifūzijas metodi vai ELISA.
• B limfocītu blastu transformācijas reakcijas uz B šūnu mitogēnu (pokeweed mitogēns B limfocītu blastu transformācijas reakcijas stimulēšanai T limfocītu klātbūtnē) izpēte, kuras normatīvā vērtība ir 95–100%.

T-šūnu saikne imunitātē

Skrīninga metodes

• Nobriedušu CD3 T-limfocītu relatīvā un absolūtā skaita noteikšana, izmantojot imunofluorescences reakciju vai plūsmas citofluorometriju, izmantojot monoklonālas anti-CD3 antivielas. Pieaugušajiem norma ir 58–76% jeb 1100–1700 šūnas/μl. T-limfocītu skaita samazināšanās liecina par imunitātes šūnu saites nepietiekamību. Tas ir raksturīgi dažiem sekundāriem un primāriem imūndeficītiem (hroniskām bakteriālām un vīrusu infekcijām: tuberkulozei, iegūta imūndeficīta sindromam, ļaundabīgiem audzējiem, hroniskai nieru mazspējai, traumām, stresam, novecošanai, nepietiekamam uzturam, ārstēšanai ar citostatiskiem līdzekļiem, jonizējošā starojuma iedarbībai). T-limfocītu skaita palielināšanās notiek imūnās hiperaktivitātes fonā vai limfoproliferatīvās slimībās. Iekaisuma gadījumā T-limfocītu skaits vispirms palielinās, bet pēc tam samazinās. T-limfocītu skaita samazināšanās neesamība norāda uz hronisku iekaisuma procesu.
• Limfocītu apakšpopulāciju novērtēšana.
  • T-helperu (anti-CD4 antivielu) skaita noteikšana. Parasti 36–55 % jeb 400–1100 šūnas/mcl. Šo šūnu skaita palielināšanās notiek autoimūnu slimību, Valdenstrēma slimības, antitransplantācijas imunitātes aktivācijas gadījumā; T-helperu skaita samazināšanās notiek hronisku bakteriālu, vīrusu, protozoju infekciju, tuberkulozes, iegūtā imūndeficīta sindroma, ļaundabīgu audzēju, apdegumu, traumu, nepietiekama uztura, novecošanās, ārstēšanas ar citostatiskiem līdzekļiem, jonizējošā starojuma iedarbības gadījumā.
  • T-supresoru (anti-CD4 antivielu) skaita noteikšana. Parasti 17–37 % jeb 300–700 šūnas/μl. T-supresoru skaita palielināšanās notiek tādos pašos apstākļos, kādos samazinās T-helperu skaits, un to samazināšanās notiek tādos pašos apstākļos, kādos palielinās T-helperu saturs.
  • Imunoregulācijas indekss CD4/CD8, parasti 1,5–2,5. Hiperaktivitāte ar vērtībām virs 2,5 (alerģiskas un autoimūnas slimības); hipoaktivitāte – mazāka par 1,0 (nosliece uz hroniskām infekcijām). Iekaisuma procesa sākumā imunoregulācijas indekss palielinās, un, tam samazinoties, tas normalizējas.

Precizējošas metodes

• Dabisko killeršūnu (NK šūnu) skaita noteikšana - anti-CD16 un anti-CD56 antivielas. CD 16 limfocītu norma ir 6-26%, CD56 - 9-19%. NK šūnu skaita palielināšanās notiek transplantāta atgrūšanas laikā, samazināšanās - vīrusu infekciju, vēža, primārā un sekundārā imūndeficīta, apdegumu, traumu un stresa, ārstēšanas ar citostatiskiem līdzekļiem un jonizējošā starojuma iedarbības gadījumā.
• T-limfocītu skaita noteikšana ar interleikīna-2 receptoru (aktivācijas marķieri) - anti-CD25 antivielas. Norma ir 10-15%. To skaita palielināšanās novērojama alerģisku slimību, transplantāta atgrūšanas, atbildes reakcijas uz aizkrūtes dziedzera atkarīgiem antigēniem gadījumā primārās infekcijas akūtā periodā, samazināšanās - tajās pašās slimībās, kurās samazinās NK šūnu skaits.
• Aktivācijas marķiera - II klases histokompatibilitātes molekulas HLA-DR - ekspresijas pētījums. Paaugstināta ekspresija rodas iekaisuma procesos, pacientiem ar C hepatītu, celiakiju, sifilisu, akūtām elpceļu slimībām.
• Limfocītu apoptozes novērtējums. Aptuvenu priekšstatu par limfocītu gatavību apoptozei var sniegt pēc Fas receptora (CD95) ekspresijas uz to virsmas un bd-2 protoonkogēna ekspresijas mitohondrijos. Limfocītu apoptozi novērtē, apstrādājot tos ar divām fluorescējošām krāsvielām: propīdija jodīdu, kas saistās ar DNS fragmentiem, un aneksīnu Y, kas saistās ar fosfatidilserīnu, kas parādās uz šūnu membrānas apoptozes sākumā. Rezultāti tiek novērtēti, izmantojot plūsmas citofluorometru. Rezultāti tiek aprēķināti, pamatojoties uz ar dažādām krāsvielām iekrāsoto šūnu attiecību. Neiekrāsotas šūnas ir dzīvotspējīgas, šūnas, kas saistītas tikai ar aneksīnu Y, ir agrīnas apoptozes izpausmes, ar propīdija jodīdu un aneksīnu Y ir vēlīnas apoptozes izpausmes, iekrāsošana tikai ar propīdija jodīdu norāda uz nekrozi.
• T-limfocītu proliferācijas novērtējums in vitro.
  • Izmaiņas šūnu blastoģenēzē - limfocītu blastu transformācijas reakcija. Leikocītus inkubē ar jebkuru augu izcelsmes mitogēnu (lektīniem). Fitohemaglutinīnu visbiežāk lieto 72 stundas, pēc tam ņem uztriepi, iekrāso un saskaita blastu skaitu! Stimulācijas indekss ir transformēto šūnu procentuālā daudzuma attiecība eksperimentā (kultūra ar fitohemaglutinīnu) pret transformēto šūnu procentuālo daudzumu kontrolē (kultūra bez fitohemaglutinīna). Limfocītu blastu transformācijas reakciju var novērtēt, iekļaujot radioaktīvu marķieri (ZN-timdīns) kultivētajās šūnās, jo DNS sintēze palielinās šūnu dalīšanās laikā. Proliferatīvās atbildes traucējumi rodas gan primārā, gan sekundārā imūndeficīta gadījumā, kas saistīts ar infekcijām, vēzi, nieru mazspēju un ķirurģiskām iejaukšanās reizēm.
  • Šajos pētījumos tiek novērtēta aktivācijas marķieru (CD25, transferīna receptora - CD71) un galvenā histosaderības kompleksa II klases HLA-DR molekulas ekspresija, kas praktiski nav atrodama miera stāvokļa T limfocītos. T limfocītus stimulē ar fitohemaglutinīnu, pēc 3 dienām aktivācijas marķieru ekspresiju analizē ar tiešas vai netiešas imunofluorescences reakcijas metodi, plūsmas citofluorometriju, izmantojot monoklonālās antivielas pret izolētajiem receptoriem.
  • Aktivēto T-limfocītu sintezēto mediatoru [interleikīns (IL) 2, IL-4, IL-5, IL-6, γ-interferons u.c.] daudzuma mērīšana, izmantojot radioimunoanalīzi vai ELISA. Īpaši svarīgi ir novērtēt γ-interferona un IL-4 koncentrāciju kā Th1 un Th2 marķierus aktivēto kultūru supernatantā un šūnas iekšienē. Ja iespējams, ir lietderīgi noteikt atbilstošā citokīna gēnu ekspresiju pēc matricas ribonukleīnskābes līmeņa producenta šūnā un atbilstošo citokīnu receptoru ekspresijas intensitātes.
    
• Limfocītu migrācijas inhibīcijas reakcija. Sensibilizēti T limfocīti reaģējot ar antigēnu izdala limfokīnus, tostarp faktorus, kas kavē limfocītu migrāciju. Inhibīcijas fenomens tiek novērots, kad šūnu kultūrā tiek ievadīti mitogēni. Inhibīcijas pakāpes novērtējums ļauj spriest par limfocītu spēju sekretēt citokīnus. Parasti migrācijas biežums atkarībā no konkrētā mitogēna ir 20–80%.
• NK šūnu citotoksicitātes novērtējums. Tiek noteikta dabisko galētājšūnu spēja iznīcināt K-562 eritromieloīdās līnijas mērķa šūnas. Ja tiek novērtēta no antivielām atkarīgā citotoksicitāte, tiek izmantotas mērķa šūnas, kas pārklātas ar IgG antivielām. Mērķa šūnas tiek iezīmētas ar 3H-uridīnu un inkubētas ar efektora šūnām. Mērķa šūnu bojāeju novērtē, atbrīvojot radioaktīvo marķieri šķīdumā. Citotoksicitātes samazināšanās notiek ļaundabīgo audzēju gadījumā. Dažos gadījumos, kad ir nepieciešams prognozēt ārstēšanas efektivitāti ar interleikīniem, NK šūnu citotoksicitāte tiek novērtēta inkubācijas laikā ar noteiktiem citokīniem.

Fagocītu funkcijas izpēte

Skrīninga metodes

Mikrobu šūnu absorbcijas intensitātes izpēte fagocītos (lateksa daļiņu fagocitoze, stafilokoku, E. coli vai no pacienta izolētu mikroorganismu testa kultūra). Centrifugējot heparinizētas asinis, tiek izolēta leikocītu suspensija, opsonizācijai pievieno IV asinsgrupas serumu (opsonīni ir proteīni, kas pastiprina fagocitozi). Mikrobu suspensiju atšķaida, sajauc ar leikocītiem un inkubē 120 minūtes, ņemot paraugus analīzei 30, 90, 120 minūtes pēc inkubācijas sākuma. No savāktās leikocītu suspensijas veic uztriepes. Tiek noteikti šādi fagocitozes rādītāji:

• fagocitārais indekss — to šūnu procentuālā daļa, kas fagocitozē nonāca 30 minūšu un 120 minūšu laikā pēc inkubācijas; fagocitārā indeksa (30) standarta vērtība ir 94%, fagocitārā indeksa (120) — 92%;
• fagocītu skaits - vidējais baktēriju skaits, kas atrodas intracelulāri; fagocītu skaita (30) standarta vērtība ir 11%, fagocītu skaits (120) ir 9,8%;
• fagocītu skaita koeficients — fagocītu skaita (30) attiecība pret fagocītu skaitu (120); parasti 1,16;
• Neitrofilu baktericīdais indekss — fagocītu iekšienē nogalināto mikrobu skaita attiecība pret kopējo absorbēto mikrobu skaitu; parasti 66 %.

Precizējošas metodes

• Fagocītu baktericīdās spējas pētījums testā ar nitrozilā tetrazolija (NBT) - NBT tests. Leikocītiem pievieno dzelteno nitrozilā tetrazolija krāsvielu. Kad neitrofils absorbē krāsvielu, brīvo skābekļa radikāļu ietekmē notiek reducēšanās process, kā rezultātā rodas zila krāsa. Reakcija tiek veikta 96 iedobju plakandibena plāksnē. Pirmajās trīs iedobēs kopā ar NBT un leikocītu maisījumu pievieno Henksa šķīdumu (spontānu NBT), bet otrajā pievieno lateksa daļiņas; maisījumu inkubē 37 °C temperatūrā 25 minūtes. Rezultātus nolasa pie 540 nm lasītājā un izsaka patvaļīgās vienībās. Tiek aprēķināts stimulācijas koeficients (K _st ), kas vienāds ar optiskā blīvuma attiecību stimulētajās iedobēs pret vidējo optisko blīvumu iedobēs bez stimulācijas. Veseliem cilvēkiem NBT _spontāns = 90 ± 45 CU, NBT _stimul = 140 ± 60 CU. K _st = 1,78 ± 0,36.
• Adhēzijas molekulu pētījums. Plūsmas citofluorometriju izmanto, lai noteiktu virsmas antigēnu CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18 ekspresiju. Imūndeficīts ar traucētu adhēziju izpaužas kā atkārtotas infekcijas, lēna brūču dzīšana un strutu neesamība infekcijas perēkļos.

Komplementa sistēmas izpēte

Skrīninga metodes

Komplementa hemolītiskās aktivitātes noteikšana ir klasiskā komplementa aktivācijas ceļa pētījums. Dažādi seruma atšķaidījumi no slima un vesela cilvēka tiek pievienoti ar antivielām pārklātiem eritrocītiem. Hemolītiskās aktivitātes mērvienība ir seruma atšķaidījuma apgrieztā vērtība, pie kuras tiek iznīcināti 50% eritrocītu. Hemolīzes pakāpi fotometriski novērtē pēc hemoglobīna izdalīšanās šķīdumā. Komplementa hemolītiskās aktivitātes samazināšanās novērojama sistēmiskās sarkanās vilkēdes ar nieru bojājumiem, akūta glomerulonefrīta, kombinēta imūndeficīta, miastēnijas, vīrusu hepatīta, limfomu gadījumā, bet palielināšanās - obstruktīvas dzeltes, Hašimoto tireoidīta, reimatisma, reimatoīdā artrīta, mezglaina periarterīta, dermatomiozīta, miokarda infarkta, čūlainā kolīta, Reitera sindroma, podagras gadījumā.

Precizējošas metodes

• Komplementa komponentu noteikšana. Kvantitatīvo noteikšanu veic ar radiālo imunodifūziju un nefelometriju.
  Pētījums nav informatīvs, ja vien netiek mainītas komplementa komponentu antigēnās īpašības.
• Ir noteikts, ka komplementa Clq komponents pastiprina fagocitozi un mediē šūnu citotoksicitāti. Tā samazināšanās notiek imūnkompleksu slimību, sistēmiskās sarkanās vilkēdes, strutainu infekciju un audzēju gadījumā.
• C3 komponents ir iesaistīts klasiskā un alternatīvā komplementa ceļa aktivācijā. Tā koncentrācijas samazināšanās ir saistīta ar hroniskām bakteriālām un sēnīšu infekcijām, cirkulējošu vai audu imūnkompleksu klātbūtni.
• C4 komponents ir iesaistīts klasiskā ceļa aktivācijā. Tā koncentrācijas samazināšanās ir saistīta ar ilgstošu komplementa aktivāciju ar imūnkompleksiem un C1 inhibitora koncentrācijas samazināšanos, kas kontrolē klasiskā komplementa ceļa aktivāciju. C4 deficīts rodas sistēmiskās sarkanās vilkēdes gadījumā, C4 līmeņa paaugstināšanās rodas nieru slimību, transplantāta atgrūšanas, akūta iekaisuma un kuņģa-zarnu trakta slimību gadījumā.
• C5a ir neliels C5 molekulas fragments, kas no tās atdalās komplementa sistēmas aktivācijas rezultātā. Tā koncentrācija palielinās iekaisuma, sepses, atopisku un alerģisku slimību laikā.
• Cl inhibitors ir daudzfunkcionāls faktors. Tas kontrolē komplementa komponenta C1 aktivāciju, kavē kallikreīna, plazmīna un aktivētā Hāgemana faktora, Cls un Or proteāžu aktivitāti. C1 inhibitora deficīts izraisa angioedēmu.
• Komplementa funkcionālie pētījumi. Testa serumu pievieno standarta serumam, kurā nav neviena komplementa komponenta, un nosaka komplementa hemolītisko aktivitāti. Ja hemolītiskā aktivitāte netiek atjaunota līdz normai, šī komplementa komponenta aktivitāte testa serumā tiek uzskatīta par samazinātu.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ]