Fermentu un citokīnu loma osteoartrīta patoģenēzes procesā

Pēdējos gados liela daļa pētījumu ir koncentrēti uz tādu proteāžu identificēšanu, kas ir atbildīgas par locītavu skrimšļa ECM degradāciju osteoartrīta gadījumā. Saskaņā ar mūsdienu idejām svarīga loma osteoartrīta patoģenēzes spēlē ir matricas metālproteāzes (MMP). Pacientiem ar osteoartrītu ir paaugstināts trīs MMP pārstāvju skaits - kolagēzes, stromelizīni un želatināzes. Kolagenāzes ir atbildīgs par degradāciju native kolagēna, stromelizìns - kolagēna IV tipa, laminin un proteoglikānu, azhelatinaza - par degradāciju želatīna, kolagēna IV, VH XI veidi elastīna. Turklāt, tā pieņem, ka pastāv cita fermenta - aggrecanase kam ir īpašības MMP un ir atbildīgs par proteolīzi skrimšļu proteoglikānu apkopojumiem.

Locītavu skrimslis cilvēka collagenases identificē trīs veidu līmeni, kas ir paaugstināts pacientiem ar osteoartrītu - kolagenāzes-1 (MMP-1), kollagenâze-2 (MMP-8), kollagenâze-3 (MMP-13). Trīs dažādu kolagēnu tipu līdzāspastāvēšana locītavu skrimsā norāda uz to, ka katrai no tām ir sava specifiskā loma. Tiešām, ka kolagenāze-1 un -2 ir lokalizētas galvenokārt virsējās un augšējā starpzonā no locītavu skrimšļa, kamēr kollagenâze-3 ir atrodams apakšā starpproduktu un dziļi zonās. Vēl vairāk, imūnhistoķīmiskiem pētījumu rezultāti liecina, ka progresēšanu osteoartrīta līmeņa kolagenāzes-3 laikā sasniedz plato vai pat samazinās, bet līmenis kolagenāzes-1 ir pakāpeniski palielinājies. Ir pierādījumi, ka osteoartrīts kolagenāzes-1 ir galvenokārt iesaistīti iekaisuma procesā locītavu skrimšļa, bet kolagenāzes-3 - audu remodeling. Kritagīns-3, kas izteikts pacientiem ar OA skrimšļa, intensīvāk veic II tipa kolagēna degradāciju nekā kolagēza-1.

Pārstāvji no otrās grupas metalloproteâzes Human stromelizinovu identificēts kā trīs - stromelizìns-1 (MMP-3), stromelizìns-2 (MMP-10) un stromelizìns-3 (MMP-11). Mūsdienās ir zināms, ka patoloģiskā procesā osteoartrīts ir iesaistīts tikai stromelizīns-1. In sinoviālā membrāna pacientiem ar osteoartrītu, kas nav noteikts stromelizìns-2, bet tas ir atrodams ļoti mazos daudzumos sinoviālajās fibroblastu pacientu ar reimatoīdo artrītu. Stromelizìns-3, arī konstatēts sinovijā pacientu ar reimatoīdo artrītu netālu fibroblastu, jo īpaši tādās fibrozi.

Grupā gelatinases cilvēka skrimšļa audos identificē tikai divi - 92 kDa gelatinase (gelatinase B, vai MMP-9) un 72 kDa gelatinase (gelatinase A, vai MMP-2); pacientiem ar osteoartrītu tiek noteikts 92 kD želatināzes līmenis.

Ne tik sen tika identificēta vēl viena MMP grupa, kas lokalizēta šūnu membrānas virsmā un tiek saukta par MMP membrānu (MMP-MT). Uz šo grupu pieder četri enzīmi - MMP-MT1-MMP-MT-4. MMP-MT ekspresija ir atrodama cilvēka locītavu skrimsā. Kaut MMP-MT-1 ir īpašības kolagenāzes, abi fermenti MMP MT-MMP-1 un MT-2 spējīgs aktivirovatzhelatinazu-72 kD un kollagenâze-3. Šīs MMP grupas loma OA patoģenēzē prasa pilnveidošanu.

Proteīnāzes izdalās zymogēna formā, ko aktivizē citi proteīni vai dzīvsudraba organiskie savienojumi. MMP katalītiskā aktivitāte ir atkarīga no cinka klātbūtnes fermenta aktīvā zonā.

MMP bioloģisko aktivitāti kontrolē specifiski TIMP. Līdz šim ir identificēti trīs TIMP veidi, kas atrodami cilvēka locītavu audos TIMP-1-TIMP-3. TIMP ceturtais veids ir identificēts un klonēts, bet tas vēl nav atrasts cilvēka locītavu audos. Šīs molekulas saistās konkrēti uz aktīvās vietas MMP, lai gan daži no tiem ir spējīgs saistīties aktīvās vietas 72 kDa progelatinase (TIMP-2, -3, -4) un 92 kDa progelatinase (TIMP-1 un -3). Šie dati liecina, ka OA locītavu skrimšļu nelīdzsvarotību MMP un TIMPs, ka rezultātā veidojas relatīvo deficītu inhibitoru, kas var būt daļēji saistīta ar pastiprinātu MMP aktivitāti audos. TIMP-1 un -2 ir atrodami locītavu skrimsā, tos sintezē hondrocīti. Ar osteoartrītu sinoviālajā membrānā un sinovialā šķidrumā konstatēts tikai pirmais TIMP tips. TIMP-3 tiek noteikts tikai ECM. TIMP-4 ir gandrīz identiska aminoskābju secība ar TIMP-2 un -ZINA apmēram 38% -STIMP-1 gandrīz par 50%. Citās mērķa šūnās TIMP-4 ir atbildīgs par 72 kD progestogēnāzes aktivācijas modulēšanu uz šūnu virsmas, kas norāda uz būtisku lomu kā audu specifiskajam ECM pārveidošanas regulatoram.

Vēl viens mehānisms MMP bioloģiskās aktivitātes kontrolei ir to fizioloģiskā aktivācija. Tiek uzskatīts, ka serīna un cisteīna proteāzes ģenētiski modificētie fermenti, piemēram, AP / plazmīns un katepsīns B, ir fizioloģiski MMP aktīvisti. Osteoartrītu pacientiem ar locītavu skrimšļiem tika konstatēts paaugstināts urokināzes līmenis (UAP) un plazmīns.

Neskatoties uz to, ka locītavu audos ir konstatēti vairāki katepsīna veidi, katepsīns B tiek uzskatīts par visticamāko MMP aktivētāju skrimšļa veidā. Cilvēka locītavas audos tika konstatēti serīna un cisteīna proteāzes fizioloģiskie inhibitori. Pacientiem ar osteoartrītu aktivitāte inhibitora AP-1 (IAP-1), kā arī cisteīna proteāzes, ir samazināta. Līdzīgi kā MMP / TIMP, serīna un cisteīna proteāžu un to inhibitoru nelīdzsvarotība, kas var izskaidrot palielinātu MMP aktivitāti osteoartrīta pacientiem ar locītavu skrimšļiem. Turklāt MMP var aktivizēt viens otru. Piemēram, stromelizīns-1 aktivē kolagēzi-1, kolagēzi-3 un želatinazi 92 kD; Kolagēze-3 aktivē 92 kD želatinazi; MMP-MT aktivizē kolagēzi-3, un želatinaze-72 kD potenciē šo aktivāciju; MMP-MT aktivē 72 kD želatināzes. Citokīnus var iedalīt trīs grupās - destruktīvas (pro-inflammatory), regulējošas (ieskaitot pretiekaisuma) un anabolisko (augšanas faktoru).

Citokīnu tipi (saskaņā ar van den Bergu WB et al)

Iznīcinošs	Interleukīns-1 TNF-a Leikozes inhibējošais faktors Interleukīns-17
Normatīvi	Interlekin-4 Interleukīns-10 Interleukīns-13 Enzīmu inhibitori
Anaboliska	Mulsīnam līdzīgi augšanas faktori TGF-b Kaulu morfogēnie proteīni Morfogēnie proteīni, kas iegūti no skrimšļiem

Destruktīva citokīni, jo īpaši IL-1 izraisītas pieaugumu atbrīvošanu proteāzes un inhibē sintēzi proteoglikānu un collagens hondrocītus. Regulējošās Citokīni, īpaši IL-4 un -10, inhibē ražošanu IL-1 receptora antagonista, lai palielinātu ražošanas IL-1 (IL-1, RA), un samazināt līmeņa un NO-sintāzes aktivitāti hondrocītu. Tādējādi, IL-4 antagonizes IL-1 trīs veidos: 1) samazina ražošanu un novērš tās sekas, 2) palielina ražošanas bāzes "scavenger" IL-1Pa un 3) samazina ražošanu primāro sekundāro "Messenger» NR. Turklāt IL-4 samazina enzīmu audu degradāciju. In vivo apstākļos optimāls terapeitiskais efekts tiek sasniegts ar IL-4 un IL-10 kombināciju. Anaboliska faktori, tādi kakTFR-p, un IGF-1, nav īsti traucēt ar veidošanos vai darbību IL-1, bet ar pretēju darbību, piemēram, stimulē sintēzi, proteoglikānu un kolagēna, kavēšanai proteāzes aktivitāti un TGF (3, arī inhibē atbrīvošanu fermentu un stimulē to inhibitorus.

Proinflammatory citokīni ir atbildīgi par palielinātu MMP sintēzi un ekspresiju locītavu audos. Tie tiek sintezēti sinovialālajā membrānā un pēc tam izkliedējas locītavu skrimšļos caur sinoviālo šķidrumu. Proužskarojošie citokīni aktivizē hondrocītus, kas savukārt arī spēj radīt pro-inflammatory citokīnus. Osteoartrozes skarto locītavu gadījumā iekaisuma efektora lomu spēlē galvenokārt sinoviju membrānas šūnas. Makrofāgas tipa sinovīts, kas izdalo proteāzes un iekaisuma mediatorus. Starp tiem osteoartrīta patoģenēzē lielākoties tiek iesaistīti IL-f, TNF-a, IL-6, leikozes inhibējošais faktors (LIF) un IL-17.

Bioloģiski aktīvās vielas, kas stimulē locītavu skrimšļa degradāciju osteoartrīta gadījumā

• Interleukīns-1
• Interlekin-3
• Interlekin-4
• TNF-a
• Koloniju stimulējošie faktori: makrofāgi (monocīti) un granulocītu makrofāgi
• Viela P
• PGE ₂
• Plasminogēnu (audu un urokināzes tipu) un plazmīna aktivators
• Metalloproteases (kolagēzes, elastāzes, stromelizīni)
• Katepsīni A un B.
• detektīvromāns
• Bakteriālie lipopolisaharīdi
• Fosfolipāzes Ag

Literatūras dati liecina, ka IL-ip un, iespējams, TNF-a ir galvenie artēriju audu iznīcināšanas mediatori osteoartrītā. Tomēr joprojām nav zināms, vai tie darbojas neatkarīgi viens no otra vai starp tiem pastāv funkcionāla hierarhija. Par modeļiem osteoartrīts dzīvniekos tika pierādīts, ka IL-1 blokāde efektīvi novērš iznīcināšanu locītavu skrimšļa, bet blokāde TNF-alfa noved pie vājināšanos iekaisuma locītavu audos. Sinovielā, membrānā, sinoviālajā šķidrumā un pacientu skrimšļos konstatēja abu citokīnu koncentrācijas paaugstināšanos. Par hondrocītus spēj palielināt sintēzi ne tikai proteāzes (MMP un galvenokārt AP), bet arī nelielām collagens piemēram tipu I un III, kā arī samazina kolagēna sintēzi veidu II un IX un proteoglikānu. Šie citokīni stimulē arī aktīvās skābekļa sugas un iekaisuma mediatorus, piemēram, PGE ₂. Šādu makromolekulāro izmaiņu rezultātā locītavā skrimšļa ar osteoartrītu rezultāts ir remontdarbu procesa neefektivitāte, kas izraisa skrimšļa pasliktināšanos.

Iepriekšminētais proinflammatory citokīni modulēt procesus depresijas / aktivāciju, ka MMP osteoartrīts. Piemēram, disbalanss starp ar timp-1 līmeni un MMP in skrimšļaudiem osteoartrīta var būt pastarpināta ar IL-ip, jo pētījumā in vitro pierādīts, ka, palielinot koncentrāciju IL-1beta samazina koncentrāciju timp-1 un MMP palielinājās sintēzi hondrocītos. AP sintēzi modulē arī IL-1beta. Stimulation in vitro hondrocītu no locītavu skrimšļa ar IL-1 vyzyvet devas atkarīgu pieaugumu sintēzi un asu AP samazināšanās sintēzes PAI-1. Par IL-1 spēja, lai samazinātu sintēzi PAI-1 sintēzes un stimulēt AP ir spēcīgs mehānisms ģenerēšanai plazmīna aktivizāciju un MMP. Turklāt, plazmīnu ir ne tikai ferments aktivizējot citus enzīmus, tā arī piedalās degradāciju skrimšļa pa tiešo proteolīzi.

IL-ip tiek sintezēts kā neaktīvu prekursoru masu 31 kD (pre-IL-ip), Azat, pēc šķelšanu signālpeptīda, tiek pārvērsts par aktīvu citokīna no 17,5 kD svara. Audos, locītavu, ieskaitot sinoviālā membrāna un sinoviālā šķidruma locītavu skrimšļu, IL-ip konstatēta aktīvā formā, un pētījumos in vivo pierādījuši spēju sinoviālā membrāna osteoartrīta izdalīt šo citokīnu. Daži serīna proteāzes var pārveidot pirms IL-ip bioaktīvā formā. In zīdītājiem, šādas īpašības tiek atrasts tikai vienu proteāzes, kas pieder pie saimes cisteīna aspartatspetsificheskih fermentu, ko sauc par IL-1p-konvertējošā enzīma (IKF vai caspase-1). Šis ferments spēj tieši pārveidot pre-IL-ip par bioloģiski aktīvo "nobriedušu" IL-ip ar masu 17,5 kD. IKF ir propenzīms ar molekulmasu 45 kD (p45), kas lokalizēts šūnu membrānā. Pēc tam, kad proenzima p45 neproteolītiski šķelšana, lai veidotu divas apakšvienības, kas pazīstami kā P10 un P20, kas ir raksturīga ar fermentatīvo aktivitāti.

TNF-a tiek arī sintezēts kā membrānas saistīts prekursors ar masu 26 kD; izmantojot proteolītisku šķelšanos, no šūnas izdalās kā aktīva šķīstošā formā ar masu 17 kD. Proteolītisku šķelšanos veic TNF-a-konvertējošais enzīms (TNF-KF), kas pieder adamalizīnu ģimenei. AR Amins un līdzautori (1997) konstatēja, ka palielināta TNF-CF mRNS ekspresija pacientiem ar osteoartrītu locītavu skrimšļiem.

Bioloģiskais aktivizēšana hondrocītu un sinovitsitov IL-1 un TNF-a mediators, saistoties ar specifiskiem receptoriem uz šūnu virsmas - IL-R un TNF-R. Katram citokīnam tika identificēti divu veidu receptori: I un II tipu IL-IP un TNF-P I (p55) un II (p75) tipi. Lai pārraidītu signālus locītavu audu šūnās, reaģē IL-1PI un p55. IL-1P tipa I ir nedaudz lielāka afinitāte pret IL-1beta nekā IL-1a; II tipa IL-1P - gluži otrādi, tam ir lielāka afinitāte pret IL-1a nekā IL-ip. Joprojām nav skaidrs, vai IL-II II tipa II var mediēt IL-1 signālus vai tas darbojas tikai, lai konkurētspējīgi inhibētu IL-1 saistīšanu ar IL-1PI tipu. Jo hondroiitah un sinoviālā fibroblastu pacientiem ar osteoartrītu atrast lielu daudzumu IL-1PI un P55, kas savukārt izskaidro augsto jūtīgumu šo šūnu stimulācija ar citokīniem attiecīgajiem. Šis process veicina proteolītisko enzīmu sekrēcijas palielināšanos un locītavu skrimšļa iznīcināšanu.

Nav izslēgts IL-6 līdzdalība patoloģiskajā procesā osteoartrīta gadījumā. Šis pieņēmums ir balstīts uz šādiem novērojumiem:

• IL-6 palielina iekaisuma šūnu skaitu sinoviālajā membrānā,
• IL-6 stimulē hondrocītu proliferāciju,
• IL-6 uzlabo IL-1 iedarbību, palielinot MMP sintēzi un inhibējot proteoglikānu sintēzi.

Tomēr, IL-6 ir spējīgs izraisīt ražošanu timp, bet neietekmē tādēļ ražošanu MMP tiek uzskatīts, ka šo citokīnu ir iesaistīts procesā ietvērumu proteolītiskai degradāciju locītavu skrimšļus, kas tiek veikta, izmantojot atgriezeniskās saites mehānisms.

Vēl viens no IL-6 saimes pārstāvis ir LIF - citokīnu, kas tiek ražots ar hondrocītu kas iegūti no pacientiem ar osteoartrītu, atbildot uz stimulācijas ar iekaisumu izraisošo citokīnu IL-ip un TNF-a. LIF stimulē skrimšļu proteoglikānu rezorbciju, kā arī MMP un NO ražošanas sintēzi. Šīs citokīns loma osteoartrītā nav pilnībā izprotama.

IL-17 ir 20-30 kD homodimērs ar IL-1-līdzīgu darbību, bet daudz mazāk izteikts. IL-17 stimulē sintēzi un atbrīvošanu vairāku proinflammatory citokīni, ieskaitot IL-ip, TNF-a, IL-6 un MMP samazināšanai mērķa šūnās, piemēram, cilvēka makrofāgu. Turklāt IL-17 stimulē NO produkciju ar hondrocītām. Līdzīgi kā LIF, IL-17 loma OA patogenezē ir maz pētīta.

NO organiskajiem brīvajiem radikāļiem NO ir svarīga loma artēriju skrimšīšanā ar OA. Hondrocīti, kas iegūti pacientiem ar osteoartrītu, iegūst vairāk NO kā spontāni, kā arī pēc stimulēšanas ar pre-inflammatory citokīniem, salīdzinot ar parastām šūnām. Augstas koncentrācijas NO konstatēta sinoviālā šķidruma un serumā pacientiem ar osteoartrītu - ir rezultāts no palielināta vārda un sintēzes inducēto NO-sintāzes (hNOC) - enzīms NO ražošanu. Nesen tika klonēti Hondocītu specifiskā hNOC hromosoma DNA, tika noteikts fermenta aminoskābju secība. Aminoskābju secība norāda 50% identitāti un 70% līdzību hNOC specifiskai endotēlija un nieru audu analīzei.

NO inhibē locītavu skrimšļa ECM makromolekulu sintēzi un stimulē MMP sintēzi. Turklāt NO produkcijas palielināšanās ir saistīta ar hronkocītu antagonistu IL-IP (IL-1RA) sintēzes samazināšanos. Tādējādi, paaugstināts no IL-1 un samazināšanās - IL-1 RA svina hiperstimulāciju NO hondrocītus, kas savukārt izraisa pastiprinātu degradāciju skrimšļa matrices. Ir ziņojumi par selektīvās hNOC inhibitora terapeitisko efektu in vivo par eksperimentālo osteoartrīta progresēšanu.

Dabiskie citokīnu inhibitori var tieši inhibēt citokīnu saistīšanos ar šūnu membrānas receptoriem, samazinot to pretiekaisuma aktivitāti. Dabiskus citokīnu inhibitorus var iedalīt trīs klasēs atkarībā no iedarbības veida.

Pirmā inhibitoru klase ietver receptoru antagonistus, kas neļauj saistīt ligandu ar tā receptoru, konkurējot par saistīšanās vietu. Līdz šim šāds inhibitors tika atrasts tikai IL-1, iepriekš minētajam IL-1 / ILIP IL-1 PA sistēmas konkurējošajam inhibitoram. IL-1 RA bloki daudzi no ietekmi, ko novēro audos locītavu osteoartrīta, ieskaitot prostaglandīnu sintēzes ar sinoviālajās šūnās, ražošana kolagenāzes ar hondrocītu un degradāciju locītavu skrimšļa MK.

IL-1RA tiek konstatēts dažādās formās - vienā šķīstošajā (rIL-1PA) un divos starpelulajos (μIL-lPAI un μIL-1APAP). IL-1RA šķīstošās formas afinitāte ir 5 reizes lielāka nekā starpšūnu formām. Neskatoties uz intensīvu zinātnisko meklēšanu, pēdējās funkcijas nav zināmas. Eksperimety in vitro ir pierādījuši, ka inhibīciju IL-1beta darbība, kas vajadzīga koncentrācijas IL-1Pa 10-100 reizes pārsniedz limitu nosacījumiem in vivo prasa tūkstoškārtīgs koncentrācijas palielināšanos IL-1Pa. Šis fakts var daļēji izskaidrot relatīvos IL-1 RA un liekā IL-1 lūzuma trūkumu pacientiem ar osteoartrītu.

Otrā citokīnu dabisko inhibitoru klase ir citokīnu šķīstošie receptori. To cilvēku inhibitoru piemērs, kas saistīti ar osteoartrozes patoģenēzi, ir pIL-1P un pp55. Šķīstošās citokīnu receptori saīsināts formas normālas receptoriem, saistoties ar citokīnu, tie novērš to saistīšanos ar membrānu saistītā receptoriem mērķa šūnu, kas darbojas ar mehānismu konkurences antagonisms.

Galvenais šķīstošo receptoru prekursors ir ar membrānu saistīts IL-1PP. RIL-IP līdzība attiecībā pret IL-1 un IL-1 PA ir atšķirīga. Tādējādi pIL-1PH ir lielāka afinitāte pret IL-1p nekā IL-1 PA, un pIL-1PI ir lielāka afinitāte pret IL-1RA nekā IL-ip.

TNF gadījumā arī ir divu veidu šķīstošie receptori - pp55 un pp75, piemēram, šķīstošie IL-1 receptori, tos veido "sheeding" (dempinga). In vivo abos receptoros ir atrodami skarto locītavu audos. Tiek apstrīdēta šķīstošo TNF receptoru nozīme osteoartrīta patoģenēzes procesā. Tiek uzskatīts, ka zemas koncentrācijas viņi stabilizēt trīsdimensiju struktūru TNF un palielināt to eliminācijas dzīvi bioaktīvo citokīnu, bet augstas koncentrācijas PP55 un PP75 var samazināt aktivitāti TNF konkurences antagonisms. Acīmredzot pp75 var darboties kā TNF nesējs, atvieglojot tā saistīšanos ar membrānas saistīto receptoru.

Trešā klase dabas inhibitoriem citokīna pārstāv grupu pretiekaisuma citokīniem, kas ietver TGF-beta, IL-4, IL-10 un IL-13. Pretiekaisuma citokīni samazina pro-inflammatory, kā arī dažu proteāžu veidošanos, stimulē IL-1RA un TIMP ražošanu.