Šūnu transplantācijas ierobežojumi, bīstamība un komplikācijas

Plastmasas-reģeneratīvā medicīna ir balstīta uz realizācijas klīnikā un toti- īpašumiem pluripotento embrionālo cilmes un cilmes šūnām, ļaujot in vitro un in vivo, lai izveidotu iepriekš noteiktu šūnu līnijas repopulācijas bojātos audus un orgānus cilvēka pacientam.

Patiesā iespēja izmantot terapeitiskos nolūkos cilvēka embriju cilmes šūnas un cilmes šūnas galīgo audu (tā sauktās pieaugušo cilmes šūnas) vairs nav šaubu. Tomēr Amerikas Savienoto Valstu Nacionālo un medicīnas akadēmiju (ASV) eksperti iesaka izpētīt sīkāku informāciju par cilmes šūnu īpašībām eksperimentos par atbilstošiem bioloģiskiem modeļiem un objektīvi novērtēt visas transplantācijas sekas, un tikai tad izmantojiet cilmes šūnas klīnikā.

Ir konstatēts, ka cilmes šūnas ir daļa no visu trīs embriju bukletu audu atvasinājumiem. Cilmes šūnas ir atrodami tīklenes, radzenes, ādā, epidermas, kaulu smadzeņu un perifēro asiņu, asinsvados, celulozes zobu, nieres, epitēlijs gremošanas trakta, aizkuņģa dziedzera un aknu. Ar moderno metožu palīdzību tiek pierādīts, ka stumbra nieru šūnas ir lokalizētas pieaugušo smadzenēs un mugurkaulā. Šie sensacionāli atklājumi ir piesaistījuši īpašu uzmanību zinātnieku un plašsaziņas līdzekļos, kā neironiem smadzenēs bija klasisks piemērs statisko šūnu populācijas, kas nevar tikt atjaunoti. Gan agri un vēlu periodiem ontoģenēzē dēļ nervu cilmes šūnām cilvēka un dzīvnieku smadzeņu radīts neironu astrocytes un oligodendrocytes (Cilmes šūnas: zinātnisko progresu un turpmākās pētniecības virzieni Nat Inst, Veselības ASV ..).

Tomēr normālos apstākļos galīgo audu cilmes šūnas plastiskums neparādās. Lai realizētu galīgo audu cilmes šūnu plastmasas potenciālu, tiem jābūt izolētiem un pēc tam audzēti medikamentos ar citokīniem (LIF, EGF, FGF). Turklāt cilmes šūnu atvasinājumi veiksmīgi izdzīvo tikai pēc transplantācijas dzīvnieka ķermenī ar nomāktu imūnsistēmu (γ apstarošana, citostatiķi, busulfāns utt.). Līdz šim nav bijis pārliecinošu pierādījumu par cilmes šūnu plasticizitāti dzīvniekiem, kuri nav apstaroti vai citādi pakļauti dziļai imūnsupresijai.

Šādos apstākļos bīstamas potences PGCs izpaužas galvenokārt to ārpusdzemdes transplantācijas jomā - zemādas injekcijas ESK imūndeficīts pelēm injekcijas vietā veidojas teratokarcinomas. Turklāt, cilvēka embrija attīstības biežums ir hromosomu anomālijas nekā embryogenesis dzīvniekiem laikā. Pie blastocistas stadijā tikai 20-25% no cilvēka embrijiem sastāv no šūnām ar normālu kariotips un nospiedošā vairākumā agrīnās cilvēku embrijus, kas iegūti pēc apaugļošanas in vitro hromosomu mosaicism konstatēti haotiska un ļoti bieži skaitlisko un struktūras izmaiņas.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]

Cilmes šūnu labvēlīga ietekme

Klīnisko pētījumu provizoriskie rezultāti apstiprina cilmes šūnu labvēlīgo ietekmi uz pacientu, taču līdz šim nav informācijas par šūnu transplantācijas ilgtermiņa sekām. Literatūrā sākotnēji dominē ziņojumiem pozitīviem rezultātiem transplantāciju smadzeņu fragmentiem embriju Parkinsona slimības, bet pēc tam sāka parādīties datus noliegt efektīvu terapeitisko iedarbību embrija vai augļa nervu audos pārstādīti smadzenes pacientiem.

In vidū XX gadsimta atjaunošana asinsradi pirmo reizi tika atklāts nāvīgi apstarotas dzīvniekiem pēc intravenozas pārlejot kaulu smadzeņu šūnas, un 1969. Gadā amerikāņu pētnieks D. Tomass veica pirmo kaulu smadzeņu transplantācijas cilvēks. Zināšanu par mehānismu imunoloģisko nesaderība kaulu smadzeņu donoru un saņēmēju, vienlaikus izraisa augstu mirstības dēļ bieži neprizhivleniya transplantāts un attīstības reakcija "transplantāts pret uzņēmēja". No galvenā audu saderības kompleksa, kas sastāv no cilvēka leikocītu antigēnu (HBA), un uzlabot metodes rakstīt ir iespējams būtiski palielināt dzīvildzi pēc kaulu smadzeņu transplantācijas, kas noveda pie plašu šo metodi ārstēšanas ar onkoloģijas un hematoloģijā atklāšana. Pēc desmit gadiem tika veikta pirmā hematopoētisko cilmes šūnu transplantācija (HSC), kas iegūta perifērās asinīs ar leikoferezes palīdzību. 1988. Gadā Francijā, lai ārstētu bērnu ar Fankoni anēmiju kā avotu HSCs tas pirmo reizi tika izmantots nabassaites asinis, un presē 2000. Gada beigās sāka parādīties par spēju HSCs atšķirtu šūnās dažādu audu veidiem, kas, iespējams, paplašina darbības jomu, to klīniskās izmantošanas. Tomēr izrādījās, ka transplantācijas materiālam kopā ar GSK ir ievērojams skaits nehemopoētisku šūnu, kas pēc sava rakstura un īpašībām ir daudzveidīgi. Saistībā ar to tiek izstrādātas metodes potzaru attīrīšanai un tās šūnu tīrības novērtēšanas kritēriji. Jo īpaši tiek izmantota pozitīva CD34 + šūnu imūnsekcija, kas ļauj izdalīt HSC ar monoklonālo antivielu palīdzību.

[8], [9], [10], [11], [12]

Cilmes šūnu terapijas komplikācijas

Kaulu smadzeņu transplantācijas komplikācijas visbiežāk ir hematoloģiskas un saistītas ar ilgstošu jatrogēnas pancitopēnijas periodu. Visbiežāk sastopamās infekcijas ir anēmija, anēmija un asiņošana. Šajā sakarā ir ļoti svarīgi, kā atrast optimālo paraugu ņemšanas režīmu, apstrādi un uzglabāšanu kaulu smadzeņu maksimālu saglabāšanu cilmes šūnas, kas nodrošina asinsradi strauju un stabilu atveseļošanos. Sintēzes raksturojumā pašlaik ir pieņemts novērtēt šādus parametrus: mononukleāro un / vai nukleozīnu šūnu skaits, koloniju veidojošās vienības un SB34 pozitīvo šūnu saturs. Diemžēl šie rādītāji sniedz tikai netiešu novērtējumu par cilmes šūnu transplantācijas populācijas reālo hematopoētisko spēju. Mūsdienās ir absolūti precīzi parametri, lai noteiktu transplantāta pietiekamību hemopoēzes ilglaicīgai atgūšanai pacientiem pat autologu kaulu smadzeņu transplantācijā. Kopējo kritēriju izstrāde ir ārkārtīgi sarežģīta, jo trūkst stingru pārstrādes standartu, kriobes saglabāšanas un transplantātu pārbaudes. Turklāt ir jāņem vērā dažādi faktori, kas ietekmē hematopoēzes sekmīgas reģenerācijas parametrus katrā konkrētā pacientā. Jo autologo kaulu smadzeņu transplantācija svarīgākais no tiem ir vairākas iepriekšējas ārstēšanas režīmiem, jo īpaši kondicionēšana shēma, periods, slimības, kas tiek ražots no kaulu smadzeņu kolekcija shēma pieteikuma koloniju stimulējošo faktoru pēctransplantācijas periodā. Turklāt nevajadzētu aizmirst, ka ķīmijterapija, kurai seko potēšana ar augļiem, var negatīvi ietekmēt kaulu smadzeņu cilmes šūnas.

Smagas toksiskas komplikācijas biežums ievērojami palielinās ar alogēnu kaulu smadzeņu transplantāciju. Šajā sakarā ir interesanti statistikas dati par alogēno kaulu smadzeņu transplantāciju, kas rodas talasēmijā. Eiropas kaulu smadzeņu šūnu transplantācijas grupas ziņojumos pacientiem ar lielu talasēmiju tika reģistrēti apmēram 800 kaulu smadzeņu transplantācijas gadījumi. Alogēnas transplantācijas talasēmiju vairumā gadījumu veic no HLA-identisks vecvecākus, kas ir saistīta ar smagu komplikācijām un augstāku mirstību transplantācijas cilmes šūnu materiāliem, kas saistās daļēji saderīgu vai saskaņoto nesaistīto donoriem. Lai samazinātu letālu infekcijas komplikāciju risku, pacienti tiek novietoti izolētās aseptiskās kastēs ar lamināro gaisa plūsmu, saņem mazu vai abakteriālu diētu. Zāļu baktēriju attīrīšanai per os jāparedz antibiotiku, pretsēnīšu zāļu rezorbējošas formas. Lai novērstu intravenozai amfotericīnu B. Novēršana sistēmisku infekciju fiksēto amikacīnu un ceftazidīms, kurš apzīmē dienu pirms transplantācijas, tajā pašā laikā turpinot ārstēšanu, lai izpildītu pacientiem. Visi asins preparāti pirms apstarošanas tiek apstaroti devā 30 Gy. Parenterāla barošana transplantācijas laikā ir priekšnoteikums, un tā sākas tūlīt, ierobežojot pārtikas piedevu dabiski.

Vairāki komplikācijas, kas saistītas ar augstu toksicitāti imūnsupresīvo medikamentu, kas bieži izraisa sliktu dūšu, vemšanu un gļotādas iekaisums, nieru bojājumus, un intersticiāla pneimonija. Viena no smagākajām ķīmijterapijas komplikācijām ir vēnu okluzīvā aknu slimība, kas noved pie nāves agrīnā pēc transplantācijas periodā. Starp riska faktori vēnu tromboze portāla sistēmu, aknu jāatzīmē pacienta vecuma, klātbūtne no hepatīta un aknu fibrozes, un turot imūnsupresīvu terapiju pēc kaulu smadzeņu transplantācija. Venookklyuzionnaya slimība ir īpaši bīstama, talasēmiju, kurā kopā ar hemosiderosis aknu fibrozi un hepatītu - biežas satelīti pārnozaru fusional terapiju. Vēnu tromboze no portāla sistēmas aknās attīstās 1-2 nedēļu laikā pēc transplantācijas un ir raksturīgs ar strauju asins bilirubīnu un transamināzes, progresējošas hepatomegālijas ascītu, encefalopātijas, un sāpes vēdera augšdaļā. Histoloģiski sekciju materiāls definēts endotēlija bojājumi, subendothelial asinsizplūdums, bojājumu tsentrolobulyarnyh hepatocīti, trombozes obstrukcija aknu venules un centrālo vēnu. Pacientiem ar talasēmiju ir aprakstīti letālas sirds apstāšanās gadījumi, kas saistīti ar citostatiskiem toksiskiem efektiem.

Sagatavojot transplantāciju, ciklofosfamīds un busulfāns bieži izraisa toksisku hemorāģisko cistītu ar patoloģiskām izmaiņām uroepiteliālajās šūnās. Lietošana ciklosporīna A kaulu smadzeņu transplantācija bieži ir saistīta ar ietekmi nefrotoksiskumu un neirotoksicitāti, hipertensiju un sindromu, ar šķidruma aizturi un citolīzei hepatocītos. Sievietes biežāk novēro seksuālās un reproduktīvās funkcijas pārkāpumu. Maziem bērniem pēc transplantācijas parasti cieš pubertātes attīstība, bet vecākiem bērniem ģenitāliju sfēras attīstības patoloģija var būt ļoti nopietna - līdz sterilitātei. Komplikācijas ir tieši saistīti ar sevi, transplantāta tremes ietvert Allogēna kaulu smadzeņu šūnas, ABO nesaderības, akūtas un hroniskas formas reakcija "transplantāta atgrūšanas".

Pacientam, pēc transplantācijas ABO-savienojams kaulu smadzeņu idioagglutinin tipa "host pret donora ABO" izgatavots 330-605 dienu laikā pēc transplantācijas, kas var novest pie ilgstošas hemolīzes un krasu nepieciešamību asinīm. Said komplikācija tiek novērsta ar pārlejot eritrocītu grupu tikai 0. Pēc transplantācijas daudziem pacientiem ar autoimūnas neitropēnijas, trombocitopēnijas, pancitopēnija, vai, lai labotu, kura jāveic splenektomija.

In 35-40% saņēmēju akūtas reakcijas "transplantāts pret saimnieku" attīsta 100 dienu laikā pēc transplantācijas alogēnas hemoglobīna-identisks kaulu smadzenēs. No ādas bojājumu, aknu un zarnu pakāpe atšķiras no izsitumi, hiperbilirubinēmiju, caurejas un vieglas uz ādas lobīšanās, zarnu aizsprostojums, un akūtu aknu mazspēju. Talasēmijas slimnieku frekvences akūtas reakcijas "transplantāts pret saimnieku" I mērā pēc kaulu smadzeņu transplantācija, ir 75%, II un augstāka pakāpe - 11-53%. Hronisks reakcija "transplantāts pret saimnieku", kā sistēmiskas orgānu sindroms parasti attīstās 100-500 dienu laikā pēc transplantācijas alogēnas kaulu smadzenēs 30-50% pacientu. Tiek ietekmēta āda, mute, aknas, acis, barības vads un augšējo elpošanas ceļu. Atšķirt ierobežotu formu hronisku reakcijas "transplantāts pret saimnieku", ja ietekmē āda un / vai aknu, un izplatīta, ģeneralizētas ādas bojājumi, ja tā saistīta ar hronisku agresīvu hepatītu, acu slimības, siekalu dziedzeru vai jebkuru citu orgānu. Nāves cēlonis bieži vien ir infekcijas komplikācijas, ko izraisa smags imūndeficīts. In talasēmija hronisku vieglā formā reakcijas "transplantāts pret saimnieku", tika konstatēts, 12%, vidēji - 3% un smags - ir 0,9% no saņēmēju HLA-saderīgu allogēnā kaulu smadzenēs. Smaga komplikācija kaulu smadzeņu transplantācija ir transplantāta atgrūšana, kas attīstās 50-130 dienu laikā pēc operācijas. Noraidīšanas frekvence ir atkarīga no kondicionēšanas režīma. It īpaši, pacientiem ar talasēmiju sagatavošanas tikai metotreksāts laikā apstrādāts, noraidīšanu kaulu smadzeņu transplantāta tiek novērota 26% gadījumu, kombinācijas metotreksāta ar ciklosporīna A - 9%, un, ja piešķirot tikai ciklosporīns A - 8% gadījumu (Haziyev uc ., 1995).

Infekcijas komplikācijas pēc transplantācijas, kaulu smadzeņu, ko izraisa vīrusi, baktērijas un sēnītes. To attīstība ir saistīta ar dziļu neitropēniju, kas nolems ķīmijterapijas kondicionēšanas laikā citostatiķi uzvarēt gļotādas barjeru un reakcijas "transplantāts pret saimnieku". Atkarībā no laika attīstību, ir trīs fāzes infekciju. Pirmajā posmā (attīstās pirmajā mēnesī pēc transplantācijas) dominē bojājumu gļotādas barjeru un neitropēnijas, bieži vien kopā ar vīrusu infekcijām (herpes vīrusu, Epšteina-Barra vīruss, citomegalovīruss, varicella zoster), kā arī infekcijas, ko izraisa grampolozhi - iekaisuma un Gram-negatīvām baktērijām, Candida sēnīšu , Aspergillus. Jo pēctransplantācijas periodā (otrais un trešais mēnešus pēc transplantācijas) ir vissmagākā citomegalovīrusu infekcija, kas bieži noved pie nāves pacientu otrajā fāzē infekciju. Talasēmija citomegalovīrusa infekcija pēc transplantācijas, kaulu smadzeņu notiek 1.7-4.4% saņēmēju. Trešais posms ir vērojama vēlīnā pēctransplantācijas periodā (trīs mēnešus pēc operācijas), un to raksturo smags kombinēts imūndeficīts. Šis periods ir sastopams infekcijas, ko izraisa Varicella zoster, Streptococcus, Pneumocystis CARINI, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, un hepatotropic vīrusiem. Talasēmija mirstība pacientiem pēc kaulu smadzeņu transplantācija ir saistīta ar baktēriju un sēnīšu sepsi, idiopātiskas intersticiālo un citomegalovīrusa pneimonija, akūts respiratorā distresa sindroms, akūta sirds mazspējas, sirds apstāšanos, smadzeņu asinsizplūdums, venookklyuzionnoy aknu slimību un akūtu reakcijas "transplantāts pret saimnieku".

Šobrīd ir gūti zināmi panākumi, izstrādājot metodes, lai izolētu kaulus smadzenēs tīru cilmes šūnu populāciju. Ir uzlabota augļa asiņu iegūšanas no nabas saites tehnoloģija un ir izstrādātas metodes, lai izolētu asinsrades šūnas no nabassaites asinīm. Zinātniskā presē ir ziņojumi, ka, audzējot medikamentus ar citokīniem, asins cilmes šūnas spēj vairoties. Izmantojot speciāli izstrādātus bioreaktorus HSC paplašināšanai, ievērojami palielinās kaulu smadzeņu, perifēro vai nabassaites asiņu izolēto cilmes šūnu biomasa. HSC ekspansijas iespēja ir būtisks solis šūnu transplantācijas klīniskajā attīstībā.

Tomēr pirms HSC reprodukcijas in vitro ir nepieciešams izolēt homogēnu hematopoētisko cilmes šūnu populāciju. Tas parasti tiek sasniegta, izmantojot marķierus, kas ļauj selektīvi atzīmēt HSC monoklonālas antivielas, kas kovalenti saistīti ar magnētisko vai fluorescentu iezīmi, un izvēlēties tos ar piemērotu šūnu sorter. Vienlaikus jautājums par hematopoētisko cilmes šūnu fenotipiskām īpašībām nav beidzot atrisināts. A. Petrenko., V. Hryschenko (2003) kā kandidātes GSK apstrādāts šūnas, kas ir klāt uz virsmas CD34, AC133 un methyl antigēniem un nav CD38, HLA-DR un citu marķieru diferenciācijas (šūnas ar fenotipa CD34 + LiiR). Ar lineāro diferenciācijas marķieriem (Lineage, Lin) ietver glycophorin A (VIN), CD3, CD4, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20 (Muench, 2001). Uzskata par perspektīvu transplantācijai šūnas ar fenotipu CD34 + CD45RalüW CD71low, kā arī CD34 + methyl + CD38low / C-kit / zems.

Problēma joprojām ir HSC skaits, kas ir pietiekams efektīvai transplantācijai. Pašlaik cilmes asinsveidojošo šūnu avots ir kaulu smadzeņu, perifēro un nabassaites asinis, kā arī embrionālās aknas. Stumbra hemopoētisko šūnu paplašināšanās notiek, kultivējot tos endotēliocītu un hematopoētisko augšanas faktoru klātbūtnē. Dažādos protokolos tiek izmantoti mieloproteīni, SCF, eritropoetīns, insulīnam līdzīgi augšanas faktori, kortikosteroīdi un estrogēni, lai izraisītu HSC proliferāciju. Ja citokīnu kombinācijas tiek izmantotas in vitro, ievērojams HSC pudeles pieaugums var tikt sasniegts ar to izdalīšanās maksimumu otrās audzēšanas nedēļas beigās.

Tradicionāli HSC nabassaites asinis galvenokārt lieto hemoblastoīdos. Tomēr minimālā asinsrades šūnu deva, kas nepieciešama veiksmīgai nabassaites asiņu šūnas transplantācijai, ir 3,7 x 10 ⁷ nucleated cells uz 1 kg ķermeņa svara recipienta. Izmantojot mazāku HSC daudzumu, ievērojami palielinās transplantāta mazspējas risks un slimības recidīvs. Tādēļ asinsrades šūnu transplantācija nabas saites asinīs galvenokārt tiek izmantota, ārstējot hemoblastozi bērniem.

Diemžēl joprojām nav standarta tukšs, un standartizēti protokoli klīniskā nabassaites asins asinsrades šūnu izmantošanu. Attiecīgi paši cilmes šūnas no nabassaites asinīs netiek juridiski atzītas kā avotu asinsrades cilmes šūnu transplantācijas. Bez tam, nav nekādu ētisku vai juridiskās normas, kas regulē darbību un organizāciju, kas bankām nabas krovb, kas ir pieejami ārzemēs. Tikmēr drošībai transplantācija nabassaites asiņu, visi paraugi ir rūpīgi jānovēro. Pirms asins paraugu ņemšanas sākumā grūtnieces jāsaņem viņu piekrišana. Katram grūtniecība ir jāpārbauda uz pārvadājumiem HBsAg, antivielas pret C hepatīta vīrusu, HIV un sifilisu. Katrs no nabassaites asiņu paraugs jātestē uz standarta skaita kodolaino šūnu un CD34 + koloniju veidošanas spējas. Turklāt HbA veica rakstīšanu, asins grupas ABO un tās dalību Rh faktors. Testēšanas procedūras ir vajadzīgas izgriezums bakterioloģiskā sterilitāti, seroloģisko testēšanu uz HIV-1 un HIV-2 infekcijas, HBsAg, C hepatīta vīrusu, citomegalovīrusa infekcija, ntly ntly-1 un-II, sifilisu, toksoplazmoze. Bez tam, lai atklātu citomegalovīrusa un HIV polimerāzes ķēdes reakcija tiek veikta. Šķiet lietderīgi papildināt analīzi protokoli testēšanas nabassaites asins HSCs identificēt šādus ģenētiskas slimības, piemēram, talasēmiju un sirpjveida šūnu anēmija, Adenozīndezamināze deficīts, agammaglobulinēmiju Bruton, slimību Harlera un laivas stūmējs.

Nākamajā transplantācijas sagatavošanas posmā rodas jautājums par GSK saglabāšanu. Visbīstamākais šūnu dzīvotspējai to sagatavošanas laikā ir iesaldēšanas un atkausēšanas procedūras. Samazinoties hemopoētiskajām šūnām, ievērojama daļa no tām var iznīcināt kristālu veidošanās dēļ. Lai samazinātu šūnu nāves īpatsvaru, tiek izmantotas īpašas vielas - krioprotektanti. Visbiežāk kā krioprotektants DMSO tiek izmantots ar galīgo koncentrāciju 10%. Tomēr attiecībā uz DMSO šo koncentrāciju raksturo tieša citotoksiska iedarbība, kas izpaužas pat minimālās iedarbības apstākļos. Samazināta citotoksisku efektu panākt, saglabājot stingru nulles temperatūras iedarbības režīmu un regulēšana atbilstības apstrādes materiālu laikā un pēc atkausēšanas (ātrums visu manipulāciju Lietojot vairākus legalizēšanu procedūras). Nelietojiet DMSO koncentrāciju mazāk par 5%, jo šajā gadījumā asinsrites šūnu masveida nāve notiek sasalšanas periodā.

Sarkano asinsķermenīšu piemaisījumu klātbūtne suspensijas maisījumā GSK rada draudus attīstīt nesaderības reakciju pret eritrocītu antigēniem. Tajā pašā laikā, eliminējot eritrocītus, asinsvadu šūnu zudums ievērojami palielinās. Šajā sakarā tika ierosināta metode GCS nefrakcionēšanai atdalīšanai. Šajā gadījumā, lai aizsargātu kodoli šūnas no kaitīgās ietekmes zemām temperatūrām, izmantojot 10% DMSO šķīdumu un dzesēšanas konstantā ātrumā (HS / min) līdz -80 ° C, pēc tam šūnu suspenziju sasaldē šķidrajā slāpeklī. Tiek uzskatīts, ka ar šo krioaizsardzības metodi notiek eritrocītu daļēja liza, tādēļ asins paraugi neprasa frakcionēšanu. Pirms transplantācijas šūnu suspensija atkausēta, cilvēka albumīna vai seruma šķīdumā nomazgā hemoglobīnu un DMSO. Saglabāšana asinsrades cilmes izmantojot šo metodi, ir patiešām lielāks nekā pēc nabassaites asins frakcionēšanai, bet risks komplikācijas dēļ pārlejot ABO-saderīga pārliešanu eritrocītu uzglabāti.

Banku sistēmas izveide HSC testēto un HSC paraugu uzglabāšanai varētu atrisināt iepriekš minētās problēmas. Tomēr šim nolūkam nepieciešams izstrādāt ētiskas un tiesiskas normas, par kurām vēl tiek apspriesti. Pirms banku tīkla izveides ir nepieciešams pieņemt vairākus noteikumus un dokumentus par paraugu ņemšanas, frakcionēšanas, testēšanas un mašīnrakstīšanas procedūru un GCW kriokonferences procedūru standartizāciju. Priekšnoteikums efektīvas darbības banku GSK ir organizācija datu bāzēm par attiecībām ar donora kaulu smadzeņu reģistrē World Association (WMDA) un Valsts donora kaulu smadzenes no ASV programmas (NMDP).

Turklāt ir nepieciešams optimizēt un standartizēt HSC ekspansijas metodes in vitro, galvenokārt hematopoētisko nabassaites asiņu šūnās. HSC nabassaites asiņu reproducēšana ir nepieciešama, lai palielinātu potenciālo recipientu skaitu, kas ir saderīgi ar HLA sistēmu. Ņemot vērā mazu nabassaites asiņu daudzumu, tajā esošais HSC daudzums parasti nespēj nodrošināt kaulu smadzenēs populācijas atjaunošanos pieaugušiem pacientiem. Tajā pašā laikā, lai veiktu nesaistītas transplantācijas, ir nepieciešams piekļūt pietiekamam skaitam tipisku GSK paraugu (no 10000 līdz 1500000 vienam saņēmējam).

Cilpuma augšstilba šūnu transplantācija neizraisa komplikācijas, kas saistītas ar kaulu smadzeņu transplantāciju. Analīze liecina, ka nabas saites asiņu cilmes šūnu transplantācijā nopietnas akūtas "transplantācijas pret saimnieka" reakcijas formas attīstās 23%, hroniski 25% recipientu. Onkohematoloģiskajos pacientiem 26% gadījumu tiek novērota akūtas leikēmijas atkārtošanās pirmajā gadā pēc HSC nabassaites asiņu pārstādīšanas.

Pēdējos gados intensīvi attīstās perifēro hematopoētisko cilmes šūnu transplantācijas metodes. HSC saturs perifērā asinīs ir tik mazs (ir 1 GSK uz 100 000 asins šūnām), ka to izolēšana bez īpašas sagatavošanas nav jēgas. Tādēļ donoram iepriekš tiek dota zāļu stimulācija, kas saistīta ar hematopoētisko kaulu smadzeņu šūnu izdalīšanos asinīs. Šim nolūkam tiek izmantoti tādi nekaitīgi preparāti kā ciklofosfamīds un granulocītu kolonijas stimulējošais faktors. Bet pat pēc procedūras HSC mobilizēšanai perifērās asinīs, CD34 + šūnu saturs tajā nepārsniedz 1,6%.

Lai mobilizētu HSC klīnikā, visbiežāk tiek izmantots C-CEC, kam raksturīga salīdzinoši laba panesamība, izņemot gandrīz vienmērīgu sāpju parādīšanos kaulos. Jāatzīmē, ka mūsdienīgu asins separatoru izmantošana ļauj efektīvi izolēt hematopoēzes cilmes cilmes šūnas. Tomēr apstākļos normālu asinsradi, lai iegūtu pietiekamus daudzumus asinsrades cilmes šūnu, salīdzināmu spēja repopulyativnoy sіl serdes vircu, ir nepieciešams veikt vismaz sešus ārstēšanu. Ar katru šādu procedūru separators apstrādā 10-12 litrus asiņu, kas var izraisīt trombocitopēniju un leikopēniju. Atdalīšana procedūra ietver ievadot donoram antikoagulants (nātrija citrāts), kas neizslēdz, tomēr, kontakta trombocītu aktivācijas in vitro centrifugējot. Šie faktori rada apstākļus infekcijas un hemorāģisko komplikāciju attīstībai. Vēl viens metodes trūkums ir saistīts ar ievērojamu mobilizācijas reakcijas mainīgumu, kas prasa pārraudzīt HSC saturu perifēro asins donoru vidū, lai noteiktu to maksimālo līmeni.

HSC autologā transplantācija, atšķirībā no alogēnas, pilnībā izslēdz noraidīšanas reakcijas attīstību. Tomēr būtisks trūkums autologo transplantāciju asinsrades cilmes šūnu, ierobežojot klāstu norādes par tās rīcību, ir liela varbūtība reinfusion šūnu leukemic klons ar transplantācijas. Turklāt imūnsistēmas "transplantācijas pret vēzi" ietekmes trūkums ievērojami palielina ļaundabīgo asiņu slimību recidīvu biežumu. Tāpēc vienīgais veids radikālu likvidēšanai klonu hematopoētisko audzēja un atjaunotu normālu poliklonālā asinsradi mielodisplastisko sindromu ir intensīva ķīmijterapija ar alogēnas HSC transplantācijas.

Bet pat šajā gadījumā lielākajai daļai hemoblastožu ārstēšanas mērķis ir tikai palielināt pacientu izdzīvošanas laiku un uzlabot viņu dzīves kvalitāti. Saskaņā ar vairākiem lieliem pētījumiem, pēc HSC allotransplantācijas ilgstoša izdzīvošana bez slimībām tiek sasniegta 40% onkohematoloģisko pacientu. Izmantojot HbA-saderīgas brāļa mātes cilmes šūnas, labākie rezultāti novērojami jauniem pacientiem ar īsu slimības vēsturi, blasto šūnu skaitu līdz pat 10% un labvēlīgu citoģenētiku. Diemžēl mirstība, kas saistīta ar HSC allotransplantācijas procedūru pacientiem ar mielodisplastisko slimību, joprojām ir augsta (lielākajā daļā ziņojumu - aptuveni 40%). Nacionālās kaulu smadzeņu donoru programmas (510 pacienti, vidējais vecums - 38 gadi) desmit gadu darba rezultāti liecina, ka dzīvildze bez slimības nāves divus gadus ir 29% un relatīvi zems atkārtošanās iespējamība (14%). Tomēr mirstība, ko izraisa GSC alotransplantācijas procedūra no nesaistīta donora, ir ārkārtīgi augsta un sasniedz 54% divu gadu laikā. Līdzīgi rezultāti tika iegūti Eiropas pētījumā (118 pacienti, vidējais vecums 24 gadi, 2 gadu izdzīvošana bez recidīviem 28%, recidīvs 35%, mirstība 58%).

Veicot intensīvu ķīmijterapija, kam seko samazinājums alogēnas asinsrades šūnu gemopo- ētiska bieži rodas immunohematology un pārliešanas komplikāciju. Daudzējādā ziņā tie ir saistīti ar to, ka cilvēka asinsgrupas tiek mantotas neatkarīgi no MHC molekulām. Tādēļ pat tad, ja donors un recipientu ir saderīgi ar galvenajiem HLA antigēniem, to eritrocītiem var būt atšķirīgs fenotips. Piešķirt "liels" nesaderības kad iepriekš pastāvēt, kas saņem antivielas pret antigēnu donoru sarkano asins šūnu, un "small", kad donors antivielas pret antigēnu sarkano asins šūnu saņēmējam. Pastāv gadījumi, kad tiek apvienotas "lielas" un "mazas" nesaderības.

Salīdzinošās analīzes klīniskās efektivitātes kaulu smadzeņu un asinsrades cilmes šūnu nabas asins allotransplantācijas in ļaundabīgas hematoloģiskas slimības rezultāti liecina, ka bērni allotransplantation GSK nabassaites asiņu ievērojami samazināja risku reakcija "transplantāts pret saimnieku", bet ir ilgāks par neitrofīlu un trombocītu atveseļošanos lielāka frekvence 100 dienas pēc transplantācijas mirstības.

Agrīnas letalitātes cēloņu izpēte ļāva noskaidrot kontrindikācijas GSK alogēnaijai transplantācijai, no kurām svarīgākās ir:

• pozitīvu citomegalovīrusa infekcijas testu saņēmējs vai donoru klātbūtne (bez profilaktiskas ārstēšanas);
• akūta staru slimība;
• klātbūtne vai pat aizdomas par mikotiķa infekcijas klātbūtni pacientā (bez sistēmiskas agrīnas profilakses ar fungicīdiem);
• hemoblastozes, kurās pacienti saņēma ilgstošu ārstēšanu ar citostatiskiem līdzekļiem (sakarā ar pēkšņa sirdsdarbības arestēšanu un vairāku orgānu mazspēju);
• transplantācija no HLA nonintegrējošiem donoriem (neveicot akūtas transplantācijas pret uzņēmēju reakcijas ar cikloporīnu A novēršanu);
• hronisks vīrusa hepatīts C (sakarā ar augstu venozo okluzīvo aknu slimību attīstības risku).

Tādējādi HSCs transplantācija var izraisīt nopietnas komplikācijas, kas bieži noved līdz nāvei. In sākumā (līdz 100 dienas pēc transplantācijas) periods tie ietver infekcijas komplikācijas, akūta reakcija "transplantāts pret saimnieku", transplantāta atgrūšana (neprizhivlenie HSC donors), venookklyuzionnaya aknu slimības, kā arī sakarā ar kondicionēšana režīma toksicitāti, audu bojājumu, attiecībā uz kuriem augstu raksturīgs ātrums remodeling (ādas, asinsvadu endotēlija, zarnu epitēlija). Komplikācijas vēlīnā pēctransplantācijas periodā ietver hronisku reakcija "transplantāts pret saimnieku" pamatslimība atkārtošanos, augšanas aizkavēšanās bērniem, traucētas reproduktīvās funkcijas un vairogdziedzera acu slimības.

Pēdējā laikā saistībā ar publikāciju parādīšanos par kaulu smadzeņu šūnu plastiskumu ir radusies ideja par GSK lietošanu sirdstrieku un citu slimību ārstēšanā. Lai gan daži eksperimenti ar dzīvniekiem arī atbalsta šo iespēju, ir jāapstiprina secinājumi par kaulu smadzeņu šūnu plastiskumu. Šie apstākļi jāņem vērā tiem pētniekiem, kuri uzskata, ka cilvēka kaulu smadzenēs transplantētās šūnas ir viegli pārveidojamas skeleta muskuļu, miokarda vai CNS šūnās. Hipotēze, ka GSK ir dabisks šūnu reģenerācijas avots šajos orgānos, prasa nopietnu pierādījumu.

Jo īpaši, publicēja pirmos rezultātus atklātā randomizētā pētījumā Belenkova V. (2003), kura mērķis - izpētīt ietekmi C-SIS (ti, mobilizācija autologo asins HSCs) par klīnisko, hemodinamiskās un neurohumoral statusu pacienti ar vidēji smagu hronisku sirds mazspēju, kā arī tā drošības novērtējumu ar standarta terapiju (AKE inhibitoriem, beta-blokatoriem, diurētiskiem līdzekļiem, sirds glikozīdiem). Pirmā publikācija par pētniecības programmas autoru rezultātiem, ņemiet vērā, ka vienīgais arguments par labu O-CBP ir no viena pacienta ārstēšanas rezultāti, kas terapiju ar šo narkotiku laikā atrasti neapstrīdama uzlabošanos visās klīnisko un hemodinamikas rādītājiem. Tomēr teorija HSCs mobilizācijas nonāk asinsritē seko reģenerāciju miokarda ar pēcinfarkta zonā nav apstiprināts - pat pacientiem ar pozitīvu klīnisko dinamiku stresa ehokardiogrāfija ar dobutamīna neatklāja rašanos dzīvotspējīgu miokarda tādās rēta jomās laukā.

Jāatzīmē, ka šī informācija norāda uz ieteikt nomaiņa šūnu terapiju ar plašu ieviešanu ikdienas klīniskajā praksē, tas nav pietiekami. Labi izstrādāts un kvalitatīva izpilde klīniskajos pētījumos, lai noteiktu efektivitāti dažādu variantu reģeneratīvo šūnu terapiju, izstrādājot norādes un kontrindikācijas uz to, kā arī vadlīnijas par kombinēto izmantošanu, reģeneratīvo un plastmasas terapiju un parasto ķirurģiskas vai konservatīvu ārstēšanu. Līdz šim, nav atbildes uz jautājumu par kāda veida iedzīvotāju kaulu smadzeņu šūnu (asinsrades cilmes vai stromas) var izraisīt neironu un kardiomiocītos, un nav skaidrs, kādi apstākļi veicina to in vivo.

Darbs šajās jomās tiek veikts daudzās valstīs. Kopsavilkumā simpozijs par akūtu aknu mazspēju ASV Nacionālais Veselības institūts starp daudzsološās ārstēšanas metodēm, kopā ar aknu transplantācijas, transplantācijas marķētas ksenona vai alogēno hepatocītu un in vitro bioreaktori saikni ar aknu šūnām. Pastāv tiešie pierādījumi tam, ka tikai svešķermeņi, funkcionāli aktīvi hepatocīti var efektīvi atbalstīt saņēmēja aknas. Lai izolētu hepatocītu kas nepieciešami, lai izveidotu šūnu banka, kas ievērojami samazina laiku starp izlaišanas šūnu un to izmantošana klīniskajā praksē. Vispiemērotākais atsevišķu hepatocītu bankas izveidošanai ir aknu šūnu krioopārdzinājums šķidro slāpekli. Šādu šūnu izmantošana klīnikā pacientiem ar akūtu un hronisku aknu slimību atklāja pietiekami augstu terapeitisko efektu.

Neskatoties uz optimistiskiem un veiksmīgajiem rezultātiem transplantācijas aknu šūnu eksperimentā un klīnikā, joprojām daudzas problēmas vēl ir tālu no atrisināta. Tie ietver ierobežots daudzums piemērotu organizāciju, lai iegūtu izolētas hepatocītos nepietiekami efektīvas metodes, atdalīšanas, trūkst standartizētu metožu saglabāšana aknu šūnu neskaidru izpratni par mehānismiem regulējumu izaugsmei un izplatīšanu transplantāciju šūnām, tad trūkst atbilstošas metodes iemājot novērtēšanai vai noraidīšanu alogēniska hepatocītu. Tas arī jāietver klātbūtni transplantācijas imunitātes izmantojot alogēnas vai ksenogēnas šūnas, lai gan mazāk nekā orthotopic aknu transplantācijas, bet, piemērot immunosuppressive aģents, iekapsulēšanu izolētas hepatocīti vai īpašas apstrādes fermentus. Transplantācija hepatocītu bieži noved pie imūnsistēmas konfliktiem starp saņēmēju un donoru, kas noraidījuma reakcijas, kas prasa izmantot citostatiķi. Viens no šīs problēmas risinājums ir izmantot polimēru mikroporu medijus izolēt aknu šūnas, kas uzlabos viņu izdzīvošanu, jo kapsula membrāna efektīvi aizsargā hepatocītus, neskatoties uz uzņēmējas vakcinējoties.

Tomēr akūta aknu bojājuma tādā hepatocītu transplantācijas neietekmē, jo diezgan ilgu laiku, kas nepieciešams, lai iemājot aknu šūnu jaunajā vidē ar piekļuvi solis optimālu funkcionēšanu. Iespējamais ierobežojums ir sekrēciju žults ectopic transplantācijas izolētu hepatocītu, un, ja izmanto bioreaktori būtisks fizioloģiskā barjera darbojas sugu atšķirībām starp cilvēka olbaltumvielu un proteīnu, kas ražo ksenogēnisku hepatocītos.

Literatūrā ir ziņojumi, ka vietējā transplantācija kaula smadzeņu stromas cilmes šūnām veicina efektīvu korekciju kaulu defektiem, un kaulu atjaunošanu šajā gadījumā ir intensīvāks nekā spontānā reparative reģenerāciju. Vairākos Preklīniskajos pētījumos ar dzīvnieku modeļos pārliecinoši pierādījusi iespēju izmantot transplantāciju no kaula smadzeņu stromas šūnu ortopēdija gan optimizēt šīs metodes, pat vienkāršākajos gadījumos, ir jāturpina darbs. Konkrēti, optiskie osteogēno stromālo šūnu paplašināšanas apstākļi ex vivo vēl nav atrasti, to ideālā nesēja (matricas) struktūra un sastāvs paliek neapstrādāts. Minimālais šūnu skaits, kas nepieciešams kaulu atjaunošanai lielākoties, nav noteikts.

Izrādījās, ka mezenhimālo cilmes šūnas uzrāda transgermalnuyu plastiskums - spēja atšķirt uz šūnu tipiem, kas fenotipiski kas nav saistīti ar sākotnējo šūnu līnijas. Saskaņā optimālos apstākļos Poliklonālo cilmes šūnu līnijas kultūra kaula smadzeņu stromas šūnās uztur in vitro, lai vairāk nekā 50 nodaļās, kas dod iespēju saņemt miljardiem stromas šūnas no 1 ml kaulu smadzeņu aspirāts. Tomēr iedzīvotāju skaits mezenhīmas cilmes šūnu raksturo neviendabība, kas izpaužas kā mainība koloniju izmēriem, dažādiem ātrumiem veidošanās un morfoloģiskās daudzveidību šūnu tipiem - no fibroblastu līdzīgi vārpstveida lieliem plakanām šūnām. Laikā 3 nedēļu kultivēšana stromas cilmes šūnu novērota fenotipa neviendabīgumu: viena kolonija veido mezgliņus kaulu audos, bet citi - klasteri adipocītos, un citi, vairāk reti, veidojot salas skrimšļiem.

Centrālās nervu sistēmas deģeneratīvās slimības ārstēšanai vispirms tika izmantota embriju nervu audu transplantācija. Pēdējo gadu laikā embriju smadzeņu audu vietā nārstojošās neirofēras šūnas ir pārnestas (Poltavtseva, 2001). Neirofērās ir saistītas nervu prekursori un neiroglia - tas dod cerību zaudēto smadzeņu funkciju atjaunošanai pēc transplantācijas. Pēc transplantācijas šūnas uz neurospheres izkliedētas žurka Striatal smadzenes ķermenis marķētas savu proliferāciju un diferenciāciju ekspluatācijā dopamīnerģisko neironiem, kas novērš motora asimetriju žurkām ar eksperimentālo gemiparkinsonizmom. Tomēr dažos gadījumos audzēja šūnas attīstījās no neurosfēras šūnām, kas noveda pie dzīvnieku nāves (Bjorklunds, 2002).

Klīnika uzmanīgi pētījums par diviem pacientu grupām, kurās ne pacienti, ne ārsti nezināja, skatoties tos (dubultmaskējuma), ka viena grupa pacientu pārstādīt embrija audu ar neironiem, kas ražo dopamīnu, otrās grupas pacientu sniedza nepatiesu solis, deva negaidītus rezultātus . Pacienti, kuri tika pārstādīti ar embrionālajiem nervu audiem, jutīgi nebija labāki nekā kontroles grupas pacienti. Turklāt 5 no 33 pacientiem pēc 2 gadus pēc transplantācijas embrionālo nervu audos izstrādājusi pastāvīgu diskinēziju, kam nebija nekādas kontroles pacientu grupā (Cilmes šūnas: zinātnisko progresu un turpmākās pētniecības virzieni Nat inst, Veselības ASV ...). Viens no neatrisinātām problēmām klīnisko pētījumu par smadzeņu nervu cilmes šūnu analīze ir reālās perspektīvas un ierobežojumiem to atvasinājumiem transplantācijas korekcijai CNS traucējumiem. Tas ir iespējams, ka ilgstoša sagrābšana darbības izraisīta neyronogenez hippocampus, kas noved pie tā strukturālās un funkcionālās izmaiņas var būt faktors, pakāpenisku attīstību epilepsiju. Šis secinājums ir īpaši ievērības cienīgs, jo tas norāda uz iespējamo negatīvo ietekmi paaudzes jaunus neironu pieaugušo smadzeņu un veidošanos neuzticamas sinaptiskā savienojumus.

Mums nevajadzētu aizmirst, ka Audzēšanas medijos ar citoksīni (mitogēniem) tuvina īpašības cilmes šūnu, ka audzēja šūnas, jo tās notiek tuvu izmaiņām regulēšanā šūnas ciklu, nosakot spēju sadalīt bezgalīgi. Ir dumjš, ka cilvēks pārstādīs agrīnus embrionālo cilmes šūnu atvasinājumus, jo šajā gadījumā ļaundabīgo audzēju attīstības draudi ir ļoti lieli. Ir daudz drošāk izmantot viņu vairāk saistīto pēcnācēju, tas ir, diferencētu līniju prekursoru šūnas. Tomēr šobrīd vēl nav izstrādāts drošs paņēmiens stabilu cilvēka šūnu līniju iegūšanai, kas atšķiras pareizajā virzienā.

Molekulārās bioloģijas tehnoloģiju izmantošana iedzimtas patoloģijas un cilvēku slimību korekcijai ar cilmes šūnu modifikācijas palīdzību ir ļoti aktuāla praktiskajai medicīnai. Cilmes šūnu genoma īpatnības ļauj izstrādāt unikālas transplantācijas shēmas, kuru mērķis ir labot ģenētiskās slimības. Bet šajā virzienā ir arī vairāki ierobežojumi, kas jāpārvar, pirms sākas cilmes šūnu gēnu inženierijas praktiska pielietošana. Pirmkārt, ir nepieciešams optimizēt cilmes šūnu genomu modifikāciju ex vivo. Ir zināms, ka ilgstoša (3-4 nedēļas) cilmes šūnu proliferācija samazina to transfekciju, tāpēc, lai panāktu augstu ģenētiskās modifikācijas pakāpi, ir vajadzīgi vairāki transfekcijas cikli. Tomēr galvenā problēma ir saistīta ar terapeitiskā gēna izpausmes ilgumu. Līdz šim nevienā no pētījumiem faktiskās izpausmes periods pēc modificēto šūnu transplantācijas nepārsniedz četrus mēnešus. Laika gaitā 100% gadījumu transfekēto gēnu ekspresija tiek samazināta promotoru inaktivācijas un / vai šūnu nāves dēļ ar modificētu genomu.

Svarīga problēma ir mobilo tehnoloģiju izmantošanas izmaksas medicīnā. Piemēram, aprēķinātā ikgadējā finansējuma nepieciešamība tikai kaulu smadzeņu transplantācijas nodaļas medicīniskajiem izdevumiem, kas paredzēti, lai veiktu 50 transplantāciju gadā, ir apmēram 900 000 ASV dolāru.

Šūnu tehnoloģiju izstrāde klīniskajā medicīnā ir sarežģīts un daudzpakāpju process, kas ietver daudznozaru zinātnisko un klīnisko centru un starptautiskās sabiedrības konstruktīvu sadarbību. Tajā pašā laikā īpaša uzmanība tiek pievērsta pētījumu zinātniskajai organizācijai šūnu terapijas jomā. Nozīmīgākie no tiem ir klīnisko pētījumu protokolu izstrāde, klīnisko datu derīguma kontrole, valsts pētījumu reģistra izveide, integrācija daudzcentru klīnisko pētījumu starptautiskajās programmās un rezultātu ieviešana klīniskajā praksē.

Noslēdzot ievadu šūnu transplantācijas jautājumiem, es gribētu izteikt cerību, ka kopīgiem centieniem vadošo speciālistu Ukrainā no dažādām zinātnes jomām nodrošinās ievērojamu progresu eksperimentālo un klīnisko pētījumu, un ļaus tuvākajos gados, lai atrastu efektīvus veidus, kā palīdzēt smagi slimiem cilvēkiem nepieciešama orgānu transplantācija , audus un šūnas.

[13], [14], [15], [16], [17], [18]