Kristālu nogulšņu loma osteoartrīta patoģenēzē

Bāziskā kalcija fosfāta (BCP) kristāli ir atrodami sinoviālajā šķidrumā 30–60 % pacientu ar osteoartrītu. Saskaņā ar A. Swan et al. (1994) datiem, kalciju saturoši kristāli ir atrodami sinoviālajā šķidrumā daudz lielākam skaitam pacientu ar osteoartrītu; tomēr kristālu ārkārtīgi mazā izmēra vai to nelielā skaita dēļ tie netiek identificēti, izmantojot tradicionālās metodes. BCP kristālu klātbūtne sinoviālajā šķidrumā korelē ar locītavu skrimšļa deģenerācijas radiogrāfiskām pazīmēm un ir saistīta ar lielāku izsvīduma tilpumu salīdzinājumā ar izsvīdumu ceļa locītavās bez kristāliem. Pētījums par faktoriem, kas ietekmē gonartrozes radiogrāfisko progresēšanu, parādīja, ka kalcija pirofosfāta dihidrāta (CPPD) kristālu nogulsnēšanās ir nelabvēlīga klīniskā un radiogrāfiskā iznākuma prognozētājs. Pētījumā ar gados vecākiem pacientiem tika konstatēts, ka osteoartrīts ir saistīts ar hondrokalcinozi, īpaši ceļa locītavas laterālajā stilba kaula-augšstilba kaula nodalījumā un pirmajās trīs metakarpofalangeālajās locītavās. Nav nekas neparasts, ka pacientiem ar osteoartrītu ir atrodami abi kristālu veidi — gan OFC, gan PFC.

Klīniski locītavu skrimšļa deģenerācija, ko izraisa kalcija kristālu nogulsnēšanās, atšķiras no tās, kas novērojama primāras osteoartrozes gadījumā. Ja kristāli būtu vienkārša skrimšļa deģenerācijas epifenomens, tie būtu atrodami locītavās, kuras visbiežāk skar primārā osteoartroze, proti, ceļos, gūžās un mazajās roku locītavās. Turpretī kristālu nogulsnēšanās slimības visbiežāk skar locītavas, kas nav raksturīgas primārai osteoartrozei, piemēram, plecu, plaukstas locītavu un elkoņa locītavu. Kristālu klātbūtne locītavu (izsvīduma) šķidrumā ir saistīta ar smagāku locītavu skrimšļa deģenerāciju. Tiek diskutēts par to, kas ir cēlonis un kas ir sekas – kristālu nogulsnēšanās vai skrimšļa deģenerācija. Starpposmu ieņem šāds pieņēmums: primāra anomālija skrimšļa metabolismā noved pie tā deģenerācijas, un kristālu sekundāra nogulsnēšanās paātrina tā degradāciju (t. s. amplifikācijas cilpas teorija).

Precīzs mehānisms, ar kuru kalcija kristāli bojā locītavu skrimšļus, nav zināms, un tas ir apkopots turpmāk. Teorētiski kalcija kristāli var tieši bojāt hondrocītus. Tomēr histoloģiskā izmeklēšana reti atklāj kristālus hondrocītu tuvumā, un vēl retāk tie tiek uzņemti ar tiem. Visticamākais mehānisms ir kristālu fagocitoze, ko veic sinoviālā gļotādas šūnas, kam seko proteolītisko enzīmu izdalīšanās vai citokīnu sekrēcija, kas stimulē enzīmu izdalīšanos hondrocītu vidū. Šo koncepciju apstiprina pētījums par PFKD izraisīta sinovīta lomu strauji progresējoša osteoartrīta attīstībā pirofosfāta artropātijas gadījumā. Šajā pētījumā kalcija pirofosfāta dihidrāta kristāli (1 vai 10 mg) tika injicēti katru nedēļu trušu labajā celī ar osteoartrītu, ko izraisīja daļēja laterāla meniskektomija. Izrādījās, ka pēc 8 injekcijām labajā ceļa locītavā bija ievērojami nopietnākas izmaiņas salīdzinājumā ar kreiso. Sinoviālā iekaisuma intensitāte korelēja ar kalcija pirofosfāta dihidrāta kristālu intraartikulārām injekcijām un to devu. Neskatoties uz to, ka šajā pētījumā izmantotās CPPD kristālu devas pārsniedz in vivo devas, rezultāti norāda uz CPPD izraisīta iekaisuma lomu osteoartrīta progresēšanā pirofosfāta artropātijā.

Potenciālie locītavu skrimšļa bojājumu indukcijas mehānismi ar kalciju saturošiem kristāliem ir saistīti ar to mitogēnajām īpašībām, spēju inducēt MMP un stimulēt prostaglandīnu sintēzi.

Kalciju saturošu kristālu mitogēnā iedarbība. Ar kristāliem saistītu artropātiju gadījumā bieži novēro sinoviālā oderējuma šūnu proliferāciju, un paši kristāli ir tikai daļēji atbildīgi par šo procesu. Sinoviālo šūnu skaita palielināšanos pavada citokīnu sekrēcijas palielināšanās, kas veicina hondrolīzi un inducē proteolītisko enzīmu sekrēciju. OFC kristāli koncentrācijās, kas atrodamas cilvēka locītavu patoloģijā, devas atkarīgi stimulē miera stāvokļa ādas fibroblastu kultūru un suņu un peļu sinoviālo fibroblastu mitoģenēzi. Kalcija pirofosfāta dihidrāta, urāta, sulfāta, karbonāta un kalcija fosfāta kristāli stimulē šūnu augšanu. Šo kristālu izraisītās ( ^3H )-timidīna iekļaušanas sākums un maksimums ir nobīdīts par 3 stundām, salīdzinot ar šūnu stimulāciju ar asins serumu. Šis laika periods var būt nepieciešams kristālu fagocitozei un izšķīšanai. Kontroles kristālu pievienošana vienāda izmēra (piemēram, dimanta putekļu vai lateksa daļiņu) nestimulēja mitoģenēzi. Nātrija urāta monohidrāta kristāliem bija vājas mitogēnas īpašības, un tie bija ievērojami sliktāki par kalcija urāta īpašībām, kas norāda uz kristālu kalcija satura nozīmi mitoģenēzē. Sintētiskajiem OFC kristāliem bija tādas pašas mitogēnās īpašības kā kristāliem, kas iegūti no pacientiem ar hondrokalcinozi. Kalciju saturošu kristālu mitogēnā iedarbība nebija saistīta ar apkārtējās barības vides kalcija satura palielināšanos in vitro, jo bāzisko kalcija fosfāta kristālu izšķīšana barības vidē nestimulēja ( ^3H )-timidīna iekļaušanu fibroblastos.

Viens no piedāvātajiem OFC inducētās mitoģenēzes mehānismiem ir tāds, ka patoloģiska sinoviālo šūnu proliferācija var būt saistīta, vismaz daļēji, ar endocitozi un kristālu intracelulāru izšķīšanu, kas palielina citoplazmas Ca2 ⁺ koncentrāciju un aktivizē kalcija atkarīgo ceļu, kas noved pie mitoģenēzes. Šo koncepciju apstiprina nepieciešamība pēc tieša šūnu-kristālu kontakta, lai stimulētu mitoģenēzi, jo šūnu kultūru pakļaušana kristāliem inducēja šūnu augšanu, savukārt šūnu, kurām šāds kontakts nebija pieejams, pakļaušana to nedarīja. Lai pētītu kristālu fagocitozes nepieciešamību pēc šūnu-kristālu mijiedarbības, šūnas tika kultivētas ar ^45Ca -OPC un ( ^3H )-timidīnu. Tika konstatēts, ka šūnas, kas satur ^45Ca -OPC, iekļāva ievērojami vairāk ( ^3H )-timidīna nekā šūnas bez kalcija fosfāta bāzes marķēšanas. Makrofāgu kultūrās kristālu endocitozes inhibīcija ar citohalazīnu izraisīja kristālu izšķīšanas inhibīciju, vēl vairāk uzsverot fagocitozes nepieciešamību.

Kalciju saturoši kristāli šķīst skābē. Pēc fagocitozes kristāli izšķīst makrofāgu fagolizosomu skābajā vidē. Hlorokvīns, amonija hlorīds, bafilomicīns A1 un visi lizosomotrofiskie līdzekļi, kas palielina lizosomu pH, no devas atkarīgi kavē intracelulāro kristālu šķīšanu un (3H)-timidīna uzņemšanu ^fibroblastos, kas kultivēti ar bāziskiem kalcija fosfāta kristāliem.

OFC kristālu pievienošana monoslāņa fibroblastu kultūrai izraisīja tūlītēju desmitkārtīgu intracelulārā kalcija pieaugumu, kas pēc 8 minūtēm atgriezās sākotnējā līmenī. Kalcija avots galvenokārt bija ekstracelulārie joni, jo kalcija fosfāta bāziskie kristāli tika pievienoti kalciju nesaturošai barotnei. Nākamais intracelulārā kalcija koncentrācijas pieaugums tika novērots pēc 60 minūtēm un ilga vismaz 3 stundas. Šeit kalcija avots bija fagocitēti kristāli, kas izšķīdināti fagolizosomās.

Tika konstatēts, ka OFC kristālu mitogēnā iedarbība ir līdzīga PDGF iedarbībai kā augšanas faktoram; tāpat kā pēdējam, OFC kristāliem piemīt sinerģija ar IGF-1 un asins plazmu. IGF-1 blokāde samazina šūnu mitoģenēzi, reaģējot uz OFC. PG Mitchell et al. (1989) parādīja, ka mitoģenēzes indukcijai Balb/c- ₃ T3 fibroblastos _ar OFC kristāliem nepieciešama serīna/treonīna proteīnkināzes C (PKC) klātbūtne, kas ir viens no galvenajiem signālu mediatoriem, kas rodas šūnu ārējas stimulācijas laikā ar hormoniem, neirotransmiteriem un augšanas faktoriem. PKC aktivitātes samazināšanās Balb/c-3 T3 šūnās _kavēOFC mediētu protoonkogēnu c-fos un c-myc indukciju, bet neietekmē šo onkogēnu stimulāciju, ko mediē PDGF.

Šūnu kalcija līmeņa paaugstināšanās pēc fagocitizēto kristālu izšķīšanas nav vienīgais mitoģenēzes signālceļš. Kad augšanas faktori, piemēram, PDGF, saistās ar savu membrānas receptoru, tiek stimulēta fosfolipāze C (fosfodiesterāze), kas hidrolizē fosfatidilinozitola 4,5-bisfosfātu, veidojot intracelulāros ziņnešus inozitola-3-fosfātu un diacilglicerīnu. Pirmais atbrīvo kalciju no endoplazmatiskā tīkla, modulējot kalcija atkarīgo un kalcija/kalmodulīna atkarīgo enzīmu, piemēram, proteīnkināžu un proteāžu, aktivitāti.

R. Rotenbergs un H. Čungs (1988) ziņoja par palielinātu fosfatidilinozitola 4,5-bisfosfāta degradāciju ar fosfolipāzi C trušu sinoviālajās šūnās, reaģējot uz stimulāciju ar OFC kristāliem. Pēdējais ievērojami palielināja inozitola-1-fosfāta saturu šūnās ar iezīmētu ( ^3H )-inozitolu; maksimums tika sasniegts 1 minūtes laikā un saglabājās apmēram 1 stundu.

Diacilglicerīns ir potenciāls kalcija pirofosfāta dihidrāta aktivators. Tā kā OFC kristāli palielina fosfolipāzes C aktivitāti, kas noved pie diacilglicerīna uzkrāšanās, var sagaidīt PKC aktivācijas palielināšanos. PG Mitchell et al. (1989) salīdzināja OFC kristālu un PDGF ietekmi uz DNS sintēzi Balb/c- _{3T3fibroblastos}. Šūnu kultūrā PKC tika inaktivēts, inkubējot šūnas ar audzēju atbalstošu forbola diesteri (TPD), diacilglicerīna analogu. Ilgstoša stimulācija ar zemām TPD devām samazināja PKC aktivitāti, savukārt vienreizēja stimulācija ar lielu devu to aktivizēja. DNS sintēzes stimulācija ar OFC kristāliem tika nomākta pēc PKC inaktivācijas, kas norāda uz šī enzīma nozīmi OFC inducētā mitoģenēzē. Iepriekš GM McCarthy et al. (1987) pierādīja saistību starp cilvēka fibroblastu mitogēnu reakciju uz OFC kristāliem un PKC aktivāciju. Tomēr OFC kristāli neaktivizē fosfatidilinozitola 3-kināzi vai tirozīnkināzes, apstiprinot, ka šūnu aktivācijas mehānisms ar OFC kristāliem ir selektīvs.

Šūnu proliferāciju kontrolē gēnu grupa, ko sauc par protoonkogēniem. Protoonkogēnu c-fos un c-myc produkti – olbaltumvielas foe un mye – ir lokalizēti šūnas kodolā un saistīti ar specifiskām DNS sekvencēm. 3T3 fibroblastu stimulēšana ar OFC kristāliem izraisa c-fos ekspresiju dažu minūšu laikā, kas sasniedz maksimumu 30 minūtes pēc stimulācijas. c-myc transkripcijas indukcija ar OFC kristāliem vai PDGF notiek 1 stundas laikā un sasniedz maksimumu 3 stundas pēc stimulācijas. Šūnas saglabā paaugstinātu c-fos un c-myc transkripcijas līmeni vismaz 5 stundas. Šūnās ar inaktivētu PCD c-fos un c-myc stimulācija ar OFC vai TFD kristāliem ir ievērojami nomākta, savukārt šo gēnu indukcija ar PDGF nemainās.

Mitogēnu aktivētās proteīnkināzes (MAP K) saimes locekļi ir dažādu intracelulāru signālceļu kaskāžu galvenie regulatori. Viena no šīs saimes apakšklasēm, p42/p44, regulē šūnu proliferāciju, izmantojot mehānismu, kas ietver protoonkogēnu c-fos un c-jun aktivāciju. OFC un PFKD kristāli aktivizē proteīnkināzes signālceļu, kurā iesaistīti gan p42, gan p44, kas liecina par šī ceļa lomu kalciju saturošu kristālu inducētā mitoģenēzē.

Visbeidzot, OFC inducētajā mitoģenēzē ir iesaistīts transkripcijas faktors kodola faktors κB (NF-κB), kas pirmo reizi tika aprakstīts kā imūnglobulīna κ vieglās ķēdes (IgK) gēns. Tas ir inducējams transkripcijas faktors, kas ir svarīgs daudzos signālceļos, jo tas regulē dažādu gēnu ekspresiju. NF-κB indukcija parasti ir saistīta ar inhibējošu proteīnu, ko sauc par IκB, izdalīšanos no citoplazmas. Pēc NF-κB indukcijas notiek aktīvā transkripcijas faktora translokācija uz kodolu. OFC kristāli inducē NF-κB Balb/c- _3T3 fibroblastos un cilvēka ādas fibroblastos.

Pēc NF-κB aktivācijas signāla pārraidē var būt iesaistīti vairāki ceļi, taču visi ietver proteīnkināzes, kas fosforilē (un tādējādi noārda) IκB. Pamatojoties uz in vitro pētījumiem, iepriekš tika uzskatīts, ka IκB kalpo kā substrāts kināzēm (piemēram, PKC un proteīnkināzei A). Tomēr nesen ir identificēts lielas molekulmasas IκB kināzes komplekss. Šīs kināzes specifiski fosforilē IκB serīna atlikumus. NF-κB aktivācijai ar TNF-α un IL-1 nepieciešama efektīva NF-κB inducējošās kināzes (NIK) un IκB kināzes darbība. NIK aktivācijas molekulārais mehānisms pašlaik nav zināms. Lai gan OFC kristāli aktivizē gan PKC, gan NF-κB, nav zināms, cik lielā mērā šie divi procesi varētu būt saistīti. Tā kā GκB kināzes modifikācija notiek, izmantojot fosforilēšanu, nevar izslēgt PKC lomu NF-κB inducēšanā ar OFC kristāliem, izmantojot fosforilēšanu un GκB kināzes aktivāciju. Šo koncepciju apstiprina OFC kristālu inducētās mitoģenēzes un NF-κB ekspresijas inhibīcija ar PKC inhibitoru staurosporīnu. Līdzīgi staurosporīns var inhibēt GκB kināzi un tādējādi inhibē proteīnkināzi A un citas proteīnkināzes.

Tādējādi OFC kristālu inducētās mitoģenēzes mehānisms fibroblastos ietver vismaz divus dažādus procesus:

• ātrs membrānai saistošs notikums, kas izraisa PKC un MAP K aktivāciju, NF-κB un protoonkogēnu indukciju,
• ^{lēnāka kristālu intracelulārā izšķīšana, kas noved pie Ca2 +} intracelulārā satura palielināšanās un pēc tam vairāku kalcija atkarīgu procesu aktivizēšanas, kas stimulē mitoģenēzi.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ]

Indukcija ar MMP-kalciju saturošiem kristāliem

Kalcija saturošu kristālu izraisīto audu bojājumu mediatori ir MMP - kolagenāze-1, stromelizīns, 92 kD želatināze un kolagenāze-3.

Ņemot vērā saistību starp OFC kristālu saturu un locītavu audu bojājumiem, tika izvirzīta hipotēze, ka OFC kristālus un, iespējams, dažus kolagēnus fagocitē sinoviālās šūnas. Stimulētie sinovicīti proliferē un sekretē proteāzes. Šī hipotēze tika pārbaudīta in vitro, pievienojot dabiskus vai sintētiskus OFC, PFCD un citus kristālus kultivētām cilvēka vai suņa sinovicītēm. Neitrālo proteāžu un kolagenāžu aktivitāte palielinājās atkarībā no devas un bija aptuveni 5-8 reizes augstāka nekā kontroles šūnu kultūrā, kas audzēta bez kristāliem.

Šūnās, kas kultivētas kristālus saturošā vidē, tika konstatēta kolagenāzes-1, stromelizīna un želatināzes-92 kDa mRNS kopindukcija, kam sekoja enzīmu sekrēcija vidē.

OFC kristāli arī izraisīja kolagenāzes-1 un kolagenāzes-2 mRNS uzkrāšanos nobriedušos cūku hondrocītos, kam sekoja fermentu sekrēcija vidē.

GM McCarty et al. (1998) pētīja intracelulārās kristālu šķīšanas lomu kristālu inducētā MMP veidošanā. Lizosomu pH paaugstināšana ar bafilomicīnu A kavēja intracelulāro kristālu šķīšanu un arī vājināja cilvēka fibroblastu proliferatīvo reakciju uz OFC kristāliem, bet neinhibēja MMP sintēzi un sekrēciju.

Ne bāziskais kalcija fosfāts, ne PFCD kristāli in vitro neizraisīja IL-1 ražošanu, bet nātrija urāta kristāli to izdarīja.

Pašreizējie dati skaidri norāda uz tiešu MMP ražošanas stimulāciju ar fibroblastiem un hondrocītu palīdzību, saskaroties ar kalciju saturošiem kristāliem.

Osteoartrīta simptomi liecina par MMP būtisku lomu slimības progresēšanā. Kalciju saturošu kristālu klātbūtne palielina skarto locītavu audu deģenerāciju.

Prostaglandīnu sintēzes stimulēšana

Līdztekus šūnu augšanas un enzīmu sekrēcijas stimulēšanai kalciju saturoši kristāli izraisa prostaglandīnu, īpaši PGE2, izdalīšanos no zīdītāju šūnu kultūrām _. PGE2 izdalīšanās _visos gadījumos notiek pirmās stundas laikā pēc šūnu iedarbības ar kristāliem. R. Rotenbergs (1987) noteica, ka galvenie arahidonskābes avoti PGE2 sintēzei _ir fosfatidilholīns un fosfatidiletanolamīns, kā arī apstiprināja, ka fosfolipāze A2 _un NOX ir dominējošie PGE2 _ražošanas ceļi.

PGE1 var izdalīties arī, reaģējot uz OFA kristāliem. G. M. Mkartijs et al. (1993, 1994) pētīja PGE2 _, PGE un tā analoga misoprostola ietekmi uz cilvēka fibroblastu mitogēno reakciju uz OFA kristāliem. Visi trīs līdzekļi inhibēja mitogēno reakciju devatkarīgā veidā, PGE un misoprostolam uzrādot izteiktāku inhibējošo aktivitāti. PGE2 un misoprostols, bet ne PGE2 _, inhibēja kolagenāzes mRNS uzkrāšanos, reaģējot uz OFA kristāliem.

M. G. Makartijs un H. Čungs (1994) pētīja OFC mediētas šūnu aktivācijas mehānismu ar PGE. Autori parādīja, ka PGE, kas ir spēcīgāks intracelulārā cAMP induktors nekā PGE2 _un PGE, kavē OFC inducēto mitoģenēzi un MMP veidošanos, izmantojot no cAMP atkarīgu signāltransdukcijas ceļu. Iespējams, ka OFC kristālu izraisītais PGE veidošanās pieaugums vājina to citus bioloģiskos efektus (mitoģenēzi un MMP veidošanos), izmantojot atgriezeniskās saites mehānismu.

Kristālu izraisīts iekaisums

Kalciju saturoši kristāli bieži tiek atrasti pacientu ar osteoartrītu sinoviālajā šķidrumā, tomēr akūta iekaisuma epizodes ar leikocitozi ir reti sastopamas gan osteoartrīta, gan ar kristāliem saistītu artropātiju (piemēram, Milvoki pleca sindroma) gadījumā. Kristālu flogistisko potenciālu var mainīt vairāki inhibējoši faktori. R. Terkeltaubs et al. (1988) pierādīja asins seruma un plazmas spēju būtiski inhibēt neitrofilo granulocītu reakciju uz bāziskiem kalcija fosfāta kristāliem. Faktori, kas izraisa šādu inhibīciju, ir kristālus saistošie proteīni. Viena no šiem proteīniem, ₂ -HS glikoproteīna (AHSr), pētījums parādīja, ka AHSr ir visspēcīgākais un specifiskākais neitrofilo granulocītu reakcijas uz OFC kristāliem inhibitors. AHSr ir aknu izcelsmes seruma proteīns; Ir zināms, ka, salīdzinot ar citiem seruma proteīniem, tas ir atrodams relatīvi augstā koncentrācijā kaulos un mineralizējošos audos. Turklāt AHSr ir sastopams "neiekaisušā" sinoviālajā šķidrumā un ir konstatēts arī uz bāziskiem kalcija fosfāta kristāliem dabīgā sinoviālajā šķidrumā. Tādējādi nevar izslēgt iespēju, ka AHSr modulē bāzisko kalcija fosfāta kristālu flogogenitātes potenciālu in vivo.

Lai apkopotu visu iepriekš minēto, mēs piedāvājam divas osteoartrīta patoģenēzes shēmas, ko ierosināja WB van den Berg et al. (1999) un M. Carrabba et al. (1996), kas apvieno mehāniskos, ģenētiskos un bioķīmiskos faktorus.