Molekulārās ģenētiskās metodes iedzimtu slimību diagnostikai

DNS tehnoloģiju metodes tiek izmantotas, lai noteiktu lokalizāciju konkrētā hromosomā mutanta gēna, kas atbild par izcelsmes noteikta veida iedzimtām slimībām. Tā kā gēns ir DNS segmentu un gēnu mutāciju - bojājumi primāro struktūru DNS (mutācijas saprot visas izmaiņas DNS secības, neatkarīgi no to atrašanās vietas un ietekmi uz atsevišķu dzīvotspēju), tad zondēšana preparāti metafāze pacientu hromosomas iedzimta slimība, iespējams izveidot patoloģiskā gēna lokalizācija. Molekulārās ģenētikas metodes rada iespējas diagnosticēt slimības mainītās DNS struktūras līmenī, tās ļauj noskaidrot iedzimto traucējumu lokalizāciju. Molekulārās ģenētiskās metodes var atklāt mutācijas, kas saistītas ar pat vienas bāzes nomaiņu.

Vissvarīgākais gēna identifikācijas posms ir tā izolācija. DNS var izolēt no jebkāda veida audiem un šūnām, kas satur kodolus. Ar DNS izolācijas soļi ietver ātru šūnas lizējot centrifugējot noņemot fragmentiem šūnu organellās un membrānām, fermentatīvo iznīcināšanu proteīniem un to iegūšanu no šķīduma ar fenola un hloroformu, DNS koncentrāciju ar nogulsnēšanu etanolā.

Ģenētiskajās laboratorijās DNS visbiežāk tiek izolēts no leikocītu asinīm, no kuriem pacients saņēma 5-20 ml venozās asinis sterilā mēģenē ar antikoagulantu šķīdumu (heparīnu). Pēc tam leikocītus atdala un apstrādā saskaņā ar iepriekš aprakstītajiem posmiem.

Nākošais posms no materiāla sagatavošanas līdz mācību - DNS "cut" fragmentos vietās, kurās ir stingri īpašu bāžu secību, kas tiek veikta, izmantojot baktēriju enzīmu - ierobežojumu endonucleases (restrikcijas enzīmu). Restrikcijas fermenti atpazīt īpašas secības 4-6, vismaz 8-12 nukleotīdus uz divpavedienu DNS molekulas un tās kas ir sadalīts fragmentos Šo sekvenču lokalizētu vietām, ko sauc par restrikcijas vietas. Izgatavoto ierobežojošo DNS fragmentu skaitu nosaka ierobežojumu vietņu biežums, un fragmentu izmēru nosaka pēc šo vietņu sadalījuma pa sākotnējās DNS molekulas garumu. Jo biežāk atrodas ierobežošanas vietnes, jo īsāki ir DNS fragmenti pēc ierobežojuma. Pašlaik ir zināmi vairāk nekā 500 dažāda tipa baktēriju izcelsmes ierobežojošo enzīmu veidi, un katrs no šiem enzīmiem atpazīst specifisku nukleotīdu secību. Nākotnē restrikcijas vietnes var izmantot kā DNS ģenētiskos marķierus. Iegūtie DNS restrikcijas fragmenti var tikt sakārtoti pēc garuma ar elektroforēzi agarozes vai poliakrilamīdu gēli, un līdz ar to var noteikt to molekulmasa. Parasti, lai noteiktu DNS gela ar īpatnējo iekrāsošanai izmanto (parasti etīdija bromīda) un apskatot gelu pārraida gaismas ultravioleto starojumu. DNS lokalizācijas vietām ir sarkana krāsa. Tomēr personai, kas no vairākiem DNS ierobežojuma apstrādes endonucleases veidojas tik daudzas fragmenti no dažāda garuma, ka viņi nespēj jāatdala ar elektroforēzes, tas nav iespējams vizuāli identificēt atsevišķus DNS fragmenti electrophoregram (ražots vienotu krāsojumu visā garumā želeju). Tādēļ, lai identificētu vēlamos DNS fragmentus šādā gelā, tiek izmantota hibridizācijas metode ar marķētām DNS zondēm.

Jebkura vienas virknes DNS vai RNS segmenta spēja saistīties (hibridizēt) ar tās komplementāru ķēdi, un guanīns vienmēr ir saistīts ar citozīnu, adenīnu ar tīmīnu. Tas ir divšķautņu molekulas veidošanās. Ja klonēta gēna vienrindu eksemplārs ir marķēts ar radioaktīvo etiķeti, iegūst zondu. Zondes spēj atrast papildu DNS segmentu, ko pēc tam viegli identificē ar radioautogrāfiju. Radioaktīvā zonde, kas pievienota izstieptu hromosomu zālei, ļauj lokalizēt gēnu noteiktā hromosomā: dažus DNS paraugus var identificēt ar DNS zondi Southern blotting. Hibridizācija notiek, ja DNS pārbaudes daļā ir normāls gēns. Gadījumā, ja ir novērota nukleotīdu nenormāla secība, tas nozīmē, ka atbilstošās hromosomu struktūras satur mutanta gēnu, netiks novērota hibridizācija, kas ļauj noteikt patoloģiskā gēna lokalizāciju.

Lai iegūtu DNS zondes, tiek izmantota gēnu klonēšanas metode. Metodes būtība veido ar to, ka DNS fragments, kas atbilst jebkurai gēnu vai reģionā gēna ievietota klonēšanas daļiņas, kas parasti ir baktēriju plazmīdas (apļveida atdalīto DNS, kas atrodas baktēriju šūnām un veiktu rezistences gēnus pret antibiotikām), un pēc tam baktērijas ar plazmīdu ar iebūvētu cilvēka gēnu, tiek reizināts. Pateicoties sintēzes procesiem plazmīdā, ir iespējams iegūt miljardos cilvēka gēna eksemplāru vai tā vietu.

Bez tam, DNS kopijas, kas marķētas ar radioaktīvo etiķeti vai fluorohromiem, tiek izmantotas kā zondes, lai meklētu komplementārās sekvences pētāmo DNS molekulu kopumā.

Pašlaik ir daudz dažādu metožu, izmantojot DNS zondes, lai noteiktu gēnu mutācijas.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7],