Tuberkulozes laboratoriskā diagnostika

Tuberkuloze ir slimība, kuru ir viegli diagnosticēt mūsdienu apstākļos un zinātnes sasniegumos. Laboratoriska tuberkulozes diagnostika ir galvenā nozīme citās diagnostikas metodēs, otrkārt, tikai rentgenstaru pētījumu metodēm.

[1], [2], [3], [4],

Klīniskais asins analīzes

Pacientiem ar tuberkulozi asins analīzes izmaiņas nav patognomoniskas. Ar ierobežotu un neaktīvu tuberkulozes formu eritrocītu normālā daudzumā ir hipohroms. Kad masveida infiltrāti vai kazeozā pneimonija, bet izplatība kazeozais limfadenīts īpašām zarnu bojājumus, kā arī par lielu plaušu vai pēcoperācijas asiņošana un piezīmi erythropenia microcytosis, oligohromaziyu, polihromaziyu. Makrotsitozes, un it īpaši poikilicīta, sastopas daudz retāk, parasti ar smagu anēmiju. Number of retikulocītu solī tuberkulozi kompensēta svārstās no 0,1 līdz 0,6%, ar subkompensētu - no 0,6 līdz 1,0% un 1% ir raksturīga ar dekompensētu retikulocītu.

Ja tuberkulozes dažos gadījumos var būt mērena leikocitoze (līdz 15 tūkstošiem leikocītu.), Kas ir mazāk starojumu, kas notiek 2-7% pacientu ar ierobežotiem un viegls process notiek formām un par 12,5% - līdz destruktīvas un progresīva plaušu tuberkulozi .

Visbiežāk novirzes notiek leikocītu formā. Atzīmējiet gan relatīvo, gan absolūto neitrofiliju, mērenu leikocītu formulas maiņu pa kreisi pirms promielocītiem. Nemierīgo tuberkulozes gadījumā mielocīti ir ļoti reti. Neitrofilu skaita pieaugums tuberkulozes pacienta hemogramā ar patoloģisku granulāciju vienmēr norāda uz procesa ilgumu: pacientiem ar smagu tuberkulozi gandrīz visi neitrofīli satur patoloģisku granulāciju. Kad tuberkulozais uzliesmojums tiek pārtraukts, kodolmaiņa salīdzinoši ātri nonāk normālā stāvoklī. Neitrofilu patoloģiskā granulārā forma parasti saglabājas ilgāk nekā citas izmaiņas hemogramā.

Eozinofilu saturs perifērā asinīs mainās atkarībā no procesa fāzes un organisma alerģiskā stāvokļa. To skaits samazinās līdz aneozinofiliya ar smagu un ilgstošu slimību uzliesmojumu un, gluži pretēji, palielinās uzsūkšanos infiltrāti un pleiras dobumā, kā arī agrīnās formas primāro tuberkulozi.

Lielākajai daļai primārās tuberkulozes formas tiek pavadīta limfopēnija, kas dažreiz tiek novērota jau vairākus gadus, pat pēc īpašu izmaiņu radīšanas. Sekundārās tuberkulozes paasināšanās fāzē atkarībā no procesa smaguma pakāpes var būt vai nu normāls limfocītu skaits, vai limfopēnija.

Tā ieņem īpašu vietu, nosakot eritrocītu grimšanas ātrums papildu testus, lai novērtētu tuberkulozes procesu (ESR), kuru vērtība novērtējot plūsmas tuberkulozes procesu un identificēt tās aktīvās formas. Pieaugums EAR klātbūtni liecina par patoloģisko procesu (infekcijas, pretiekaisuma, strutojošs septiskā, hemoblastosis, Hodžkina et al.), Un kas liecina par to smaguma, bet normālā līmenī ESR ne vienmēr neuzrāda patoloģiju. Paātrinājums no eritrocītu grimšanas, veicina asinīs globulīnus, fibrinogēns, holesterīna pieaugumu un samazināt asins viskozitāti. Eiritrocītu sedimentācijas palēnināšana ir raksturīga valstīm, kurām ir hemokoncentrācija, palielināts albumīnu un žultsskābju saturs.

Pacientu ar tuberkulozi hemogrāfija mainās ārstēšanas laikā. Hematoloģiskās pārmaiņas pazūd ātrāk, jo veiksmīgāka ir terapeitiskā iejaukšanās. Tomēr jāpatur prātā ietekme uz dažādu antibakteriālo līdzekļu hemopoēzi. Tie bieži izraisa eozinofiliju, dažos gadījumos - leikocitozi un biežāk leikopēniju līdz agranulocitozei un limfoīdus un retikulāras reakcijas. Sistēmiskā hematoloģiskā kontrole un iegūto datu pareiza analīze ir būtiski, lai novērtētu pacienta klīnisko stāvokli, procesa dinamiku un izmantotās ārstēšanas efektivitāti.

[5], [6], [7], [8], [9],

Urīna klīniskā analīze

Ar urīnceļu tuberkulozi urīna analīze ir galvenā laboratorijas diagnostikas metode. Jūs varat novērot leikocituriju, eritrocituriju, proteīnūriju, hipoizostenuriju, tuberkulozes mikobaktēriju, nespecifisku bakteriūriju.

Leikocitūrija - visbiežāk simptoms tuberkulozes izvadorgānu sistēmas pirms ķīmijterapijas un nav specifiska tikai izņēmuma gadījumos, piemēram, pilnīga iznīcināšana lūmena urīnvada. Nechyporenko tests (skaita leikocītu 1 ml urīna) palīdz objektīvāk novērtēt pakāpi leukocyturia nefrotuberkuloze ar, un dažos gadījumos, lai noteiktu to normālu urīna analīze. Tomēr mums ir jāatceras, ka leykotsitouriya var būt akūts un hronisks pielonefrīts, cistīts, uretrīts, akmeņi nierēs un urīnvadus.

Eritrocitrija kā arī leikociturija. Tiek uzskatītas par vienu no biežākajām olnīcu sistēmas tuberkulozes laboratoriskajām pazīmēm. Hematūrijas biežums ir atkarīgs no procesa izplatības, tas palielinās, kad destruktīvā tuberkulozes process attīstās nierēs. Eritrokitūrija bez leikociturijas ir raksturīga nieru tuberkulozes agrīnā stadijā. Hematūrija, kas pārsniedz leikocituriju, ir svarīgs arguments par labu nieru tuberkulozei, to diferencējot ar nespecifisku pielonefrītu.

[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16],

Bioķīmiskais asins analīzes

Ar tuberkulozi dažu bioķīmisko parametru izmaiņas galvenokārt ir atkarīgas no procesa fāzes, sarežģījumiem un dažādām vienlaicīgām slimībām. Pacientiem ar neaktīvu plaušu un citu orgānu tuberkulozi kopējā asins seruma olbaltumvielu un olbaltumvielu frakcija ir nemainīga un nosaka to normālo saturu.

Akūtās slimības formās, kā arī ar hronisku tuberkulozes formu saasināšanos un progresēšanu samazinās albumīna-globulīna koeficients.

Essential novērtējot funkcionālā stāvokļa organisko bojājuma un aknu in tuberkulozes un tās komplikāciju ir noteikt kopējo seruma un tiešās bilirubīnu, AST (ACT), alanīna aminotransferāzes (ALT). Aminotransferāžu līmeņa dinamiskā noteikšana. Bilirubīna ārstēšanai tuberkulozes slimniekiem, īpaši smagas formas, ir obligāta sastāvdaļa tuberkulozes pacientu bioķīmiskajā pārbaudē, un to veic katru mēnesi.

Nieru funkcionālā stāvokļa novērtējums ietver kreatinīna līmeņa noteikšanu serumā un glomerulārās filtrācijas ātruma aprēķināšanu saskaņā ar Cockcroft-Gault formulējumu. Glomerulārās filtrācijas ātruma aprēķins, izmantojot Reberga paraugu, dod mazāk precīzus rezultātus.

Galvenais tuberkulozes pacientu dinamisko bioķīmisko pētījumu mērķis ir uzraudzīt procesa norisi, savlaicīgi atklāt narkotiku blakusparādības un pienācīgi koriģēt iegūtos homeostātiskos traucējumus.

[17], [18], [19]

Ārpusulmonālās tuberkulozes pētījumu bioķīmisko metožu pielietošana

Visinformatīvākais rādītājs ir tuberkulosteariskās skābes saturs bioloģiskajos šķidrumos, taču tā definīcija ir saistīta ar tehniskām grūtībām (nepieciešamība pēc gāzu hromatogrāfijas un masu spektrometrijas).

Paredzamais adenozīna deamināzes - fermenta, kas noteikts šķidrumos - aktivitātes mērīšana: sinovāls, perikardis, asciķis vai mugurkauls. Galvenie adenozīna deamināzes ražotāji ir limfocīti un monocīti. Adenozīna deamināzes aktivitātes noteikšana bioloģiskajos šķidrumos veicina tuberkulozes sinovīta, limfmezglu tuberkulozes, tuberkulozes meningīta, tuberkulozes serozīta diagnozi.

Dažu bioķīmisko rādītāju dēļ to nespecifiskums tiek noteikts tikai bioloģiskajos šķidrumos, tuvu bojājuma koncentrācijai. Novērtējiet indikatoru līmeni, reaģējot uz tuberkulīna subkutānu vai intradermālu injekciju (parasti pirms un 48 un 72 stundas pēc tam). Pēc tam marķiera līmeņa pieauguma pakāpi (%) aprēķina, ņemot vērā sākotnējo līmeni.

Opermam specifiska transamnidāzes enzīma aktivitāte urīnā, kuras izskats ir novērots dažāda rakstura nieru sabojāšanā, urīnā. Transamidāzes pētījums ir pamatots tikai ar tuberkilīna subkutānas injekcijas apstākļiem, lai pastiprinātu vietējo iekaisuma procesu. Sākotnēji un 24-72 stundas pēc 50 TE tuberkulīna ievadīšanas jānosaka transamidīna aktivitāte urīnā. Fermentiācijas paplašināšanās 2 reizes un vairāk ļauj 82% gadījumu atšķirt nieru aktīvo tuberkulozi no hroniska pielonefrīta saasināšanās.

Ar sieviešu dzimumorgānu tuberkulozi provokatīvā tuberkulīna testā tiek noteiktas haptoglobīna un malona dialdehīda koncentrācijas asinīs. Subkutāni injicēts tuberkulīns devā 50 TE un pēc 72 stundām tika veikts otrais bioķīmiskais pētījums. Tuberkulozes etioloģijas gadījumā haptoglobīna līmeņa paaugstināšanās pakāpe nav mazāka par 28%, malonialdehīda līmenis ir 39% vai vairāk. Lieto arī adenozīna deamināzes aktivitātes noteikšanu peritoneālajā šķidrumā, kas iegūts no Douglasa telpas. Punktsts tiek atkārtoti pārbaudīts 72 stundas pēc intradermālas tuberkulīna injekcijas 0,1 TE un 0,01 TE devā iekšējo dzimumorgānu projekcijai priekšējās vēdera sieniņās. Par labu tuberkulozes procesam adenozīna deaminātāžu aktivitātes pieaugums ir 10% vai vairāk salīdzinājumā ar sākotnējo.

Ja tiek skartas acis, tiek pārbaudīta fokālās reakcija, kas notiek acī, reaģējot uz antigēnu stimulāciju. Nevēlami ir izteikta atbildes reakcija, kurai pievienots redzes funkciju samazināšanās. Tā kā minimālo fokālās reakcijas novērtējums bieži vien ir grūti, secinājumu objektivizēšanai ieteicams orientēties paralēli un haptoglobīna vai adenozīna deaminātāzes asins seruma izaugsmes pakāpei.

Visi bioķīmiskie pētījumi jāveic kopā ar citām metodēm.

[20], [21], [22], [23],

Asinsreces sistēmas pētījumi

Relevance pētījuma statusa asins recēšanas sistēmā TB izraisa klātbūtni skaitam pacientu ar plaušu tuberkulozi spļaušana vai plaušu asiņošanu, kā arī hemocoagulation komplikācijas ķirurģiskas tuberkulozes ārstēšanā. Turklāt lēna intravaskulārās hemokoagulācijas plūsma, kas dabiski saistās ar tuberkulozi, ietekmē slimības gaitu un ķīmijterapijas efektivitāti.

Pacientiem ar plaušu TB izplatību eksudatīvu iekaisuma sastāvdaļu novēroto samazināšanās asinīs antikoagulantu darbību. Pacientiem ar zemu izplatību konkrētu bojājums plaušās ar pārsvars produktīvs hemocoagulation intravazālu iekaisuma komponentu nedaudz izteikts. Pacientiem ar plaušu tuberkulozi ar hemoptysis un plaušu asiņošana valsts asins recēšanas sistēmā ir atšķirīga: pacientiem ar zemu asins zudumu pie augstumā gemoptoe vai uzreiz pēc tā izbeigšanas ir krasi palielinās asins recēšanas spēju dēļ smagu intensifikāciju trombinoobrazovaniya saglabājot palielinātu "strukturālā" recēšanu. Pacientiem ar lielu asins zudumu novēroja mazina trombu veidošanos potenciālu rēķina samazinot koncentrāciju fibrinogēns. XIII faktora aktivitāte, trombocītu skaits. Posmā ķirurģiska ārstēšana pacientiem ar ierobežotām formām plaušu tuberkuloze ar būtiskiem pārkāpumiem sistēmas homeostāzes notiek. Pacienti ar plašu procesu izpildes pnevmon- vai plevropnevmonektomii bieži attīstīt DIC, kas var būt "otrā slimību."

Lai uzraudzītu stāvokli asinsreces pacientiem ar plaušu tuberkulozi jāveic noteikšanu aktivētā parciālā tromboplastīna laiks (APTL), fibrinogēns, trombīna laiku, protrombīna indekss asiņošanas laiku un recēšanas laiku.

[24], [25], [26], [27], [28]

Hormonālie pētījumi

Mūsdienu eksperimentālie un klīniskie novērojumi norāda uz hormonālā stāvokļa izmaiņām specifiskā tuberkulozā plaušu iekaisuma gadījumā. Ir pierādīts, ka korekcija hipofīzes-virsnieru, hipofīzes-vairogdziedzera sistēmas disfunkciju un aizkuņģa dziedzera funkcija apvienojumā ar anti-TB terapija, veicina aktivizēšanu fibrogenesis un remonta pie locus konkrētā iekaisumu.

Funkcionālā stāvokļa hipofīzes-vairogdziedzera sistēma tiek vērtēta pēc satura asins serumā triiodothyronine (T ₃ ), tiroksīnu (T ₄ ), hipofīzes vairogdziedzera stimulējošā hormona (TSH). Tika konstatēts, ka subklīnisku hipotireoze ir konstatēts 38-45% pacientu ar plaušu tuberkulozi, un visbiežāk tas tiek diagnosticēta izplatītas un fibro-kavernozs veidlapu procesā. Saskaņā ar šiem pašiem formu vairums krasi pazemināts gan T ₃ un T ₄, un tur nāk nelīdzsvarotība šo hormonu veidā palielinot attiecību T ₄ / T _u.

Narkoīdu dzemdes kakla funkciju novērtē ar kortisola līmeni asins serumā un aizkuņģa dziedzera pakāpenisko funkciju pēc imūnreaktīvā insulīna koncentrācijas. Infekcijas slimības akūtā fāzē palielinās nepieciešamība pēc endogēnā kortizola un insulīna. Hiperinsuliņēm arī liecina par ķermeņa audu rezistenci pret insulīnu, kas raksturīga jebkuram aktīvajam iekaisuma procesam, jo īpaši specifiskam. Noteikšana glyukokortiko idnoy-virsnieru funkcija ar aktīvo plaušu tuberkuloze atklāj klātbūtni Cushing lielākajai daļai pacientu. Normāls līmenis kortizola koncentrācijas asinīs, kas pacientam ar infekciozo iekaisumu akūtā periodā ir jāuzskata par relatīvo neveiksmi glikokortikoīdu funkciju virsnieru garozas, kas var kalpot par pamatu, kam devām atbilstošu aizvietošanas terapiju ar glikokortikoīdiem.

Gandrīz trešā daļa pacientu ar plaušu tuberkulozi var konstatēt, ka insulīnēmijas līmenis viņos ir diezgan zems un tuvojas normas apakšējai robežai, savukārt 13-20% vēro nozīmīgu hiperinsulinizmu. Gan relatīvā hipoinhronizācija, gan hiperinsulinisms ir augsta riska faktori dažādu pakāpju ogļhidrātu metabolisma pārkāpumu attīstībai. Šīs izmaiņas aizkuņģa dziedzera B šūnu funkcionālajā aktivitātē regulāri kontrolē glikēmiju pacientiem ar tuberkulozi un savlaicīgu cukura diabēta profilaksi. Papildus tas kalpo kā papildu pamatojums par insulīna fizioloģisko devu izmantošanas lietderību kompleksajā tuberkulozes terapijā.

Kopumā, zemāku vairogdziedzera hormoni un to nelīdzsvarotība hypercortisolemia un hiperinsulīnisms vislielāko nepieejamā pacientiem ar smagu gaitā tuberkulozu procesu, ar plašu plaušu bojājumus un smagas tuberkulozes simptomi intoksikācijas.

Tuberkulozes mikrobioloģiskā diagnostika

Mikrobioloģiskie pētījumi ir nepieciešami, lai identificētu pacientiem ar tuberkulozi, pārbaudes diagnozes, uzraudzību un ķīmijterapijas korekcijas izvērtējot ārstēšanas rezultātu, citiem vārdiem sakot, jo reģistrāciju pacientu tuberkuloze pirms izņemšanas no reģistra.

Visas epidemioloģiskās programmas un projekti balstās uz baktēriju ekskretoru skaita novērtējumu, ko nevar izdarīt, neizmantojot laboratorijas metodes, lai noteiktu mikobaktēriju tuberkulozi. Aptaujājot tā saukto neorganizēto iedzīvotāju, baktēriju iebrucēju procentuālais daudzums sasniedz 70 vai vairāk, kas padara laboratorijas metodes par pietiekami efektīvu līdzekli tuberkulozes pacientu identificēšanai šīs populācijas grupas vidū.

Tradicionālās mikrobioloģiskās metodes tuberkulozes diagnostikai ir bakterioskopiskas un kultūras pētījumi. Mūsdienu metodes apsver mikobaktēriju tuberkulozes audzēšanu automatizētās sistēmās, PCR noteikšanu. Tomēr visas šīs metodes obligāti apvieno ar klasiskajām bakterioloģiskajām metodēm.

Diagnostikas materiāla savākšana

Laboratorisko pētījumu efektivitāte lielā mērā ir atkarīga no diagnostikas materiāla kvalitātes. Atbilstība noteikumiem par diagnostikas materiāla savākšanu, uzglabāšanu un transportēšanu, kā arī precīzs pacienta novērtēšanas algoritma ieviešana tieši ietekmē iznākumu un nodrošina bioloģisko drošību.

Lai pārbaudītu tuberkulozi, tiek izmantoti dažādi materiāli. Sakarā ar to, ka TB logkih- visizplatītākais tuberkulozes bojājumi pamatmateriālu pētniecības uzskatīt gļotas un veic cita veida noņemamu tracheobronchial: augšējo elpceļu sekrēti, kas iegūtas pēc aerosola ieelpošanas: bronhu skalojot; bronhu alveolāro skalošana; materiālu, ko iegūst, bronhoskopija, un intrapulmonārai transtracheal biopsiju bronhu aspirāti, balsenes tamponus, izdalījumu no brūces un uztriepes al.

Pētījuma efektivitāte palielinās, ja tiek veikta kontrolēta pacienta materiāla savākšana. Šim nolūkam tiek piešķirta speciāli aprīkota telpa vai tiek iegādātas īpašas kabīnes. Materiālu savākšana ir bīstama procedūra, tādēļ ir nepieciešams savākt materiālus pētniecībai, ievērojot infekciozā drošuma noteikumus.

Materiāls testēšanai uz Mycobacterium tuberculosis tiek savākts sterilās pudelēs ar cieši pieskrūvētām vāciņiem, lai novērstu vides piesārņošanu un aizsargātu savākto materiālu no piesārņojuma.

Diagnostikas materiāla savākšanas flakoniem jāatbilst šādām prasībām:

• jābūt izgatavotam no triecienizturīga materiāla;
• būtu viegli izkausēt autoklāvā;
• pietiekamā daudzumā (40-50 ml):
• ir plaša atvere krēpu vākšanai (diametrs nav mazāks par 30 mm);
• ir viegli rīkoties, caurspīdīgs vai caurspīdīgs, lai jūs varētu novērtēt parauga daudzumu un kvalitāti, neatverot vāku.

Lai iegūtu optimālus pētījuma rezultātus, jāievēro šādi nosacījumi:

• Savāc materiālu pirms ķīmijterapijas sākuma;
• materiāls pētījumam jāsavāc pirms rīta pārtikas un zāļu lietošanas;
• pētījumam ir vēlams savākt vismaz 3 rīta šķidruma paraugus. Gatavot krēpas 3 dienas pēc kārtas;
• savāktie materiāli pēc iespējas ātrāk jānogādā laboratorijā:
• ja materiālu nekavējoties ir iespējams nogādāt laboratorijā, to uzglabā ledusskapī gaisa temperatūrā 4 ° C ne ilgāk kā 48 stundas;
• Transportējot materiālu, ir rūpīgi jāuzrauga flakonu integritāte.

Pareizi savākta krēce ir gļotāda vai gļoturulenta. Pārbaudītā krēpas optimālais tilpums ir 3-5 ml.

Kosmētika tiek savākta medicīnas speciālista uzraudzībā. Personām, kas atbildīgas par krēpu vākšanu, jāievēro konkrētu noteikumu izpilde:

• pacientam ir jāpaskaidro pētījuma mērķis un nepieciešamība klepus uzziedēt nevis siekalu vai nazofaringelālas gļotas, bet gan dziļo elpošanas ceļu saturu. To var panākt pēc produktīvā klepus, kas rodas pēc vairākām (2-3) dziļām elpām. Ir arī jābrīdina pacients, ka viņam vajadzētu izskalot muti ar vārītu ūdeni, lai noņemtu galveno mikroflora daļu, kas aug mutes dobumā, un pārtikas atlikumus, kas kavē skrimšļa izmeklēšanu;
• medicīnas darbinieks, kas piedalās krēpju vākšanā, papildus peldmētelis un cepure, ir jāvalkā maska, gumijas cimdi un gumijas priekšauts;
• stāvot aiz pacienta, viņam ieteicams pudeli turēt pēc iespējas tuvāk viņa lūpām un nekavējoties atsevišķi iekļauties sarkanā klepus, un ir jānodrošina, ka gaisa plūsma novirzīta no veselības aprūpes darbinieka:
• Pabeidzot krēpu krājumu, veselības aprūpes darbinieks uzmanīgi aizver flakonu ar vāku un novērtē savākto krēpu daudzumu un kvalitāti. Pēc tam pudele tiek marķēta un ievietota īpašā biksē transportēšanai laboratorijā.

Ja pacientam nav ražot gļotas, naktī pirms un agri no rīta, dienā kolekcijas materiāla nepieciešams, lai dotu viņam atkrēpošanas :. Izraksts no saknēm zefīrs (mukaltin), bromheksīns, Ambroksols utt - vai piemērot kairinošs ieelpošanas lietojot iekārtu uzstādīta telpā, lai savāktu šķidrums Šādā veidā savāktais materiāls netiek saglabāts, un tas jāpārbauda savākšanas dienā. Lai izvairītos no tās "izkaušanas" laboratorijā virzienā būtu īpaša zīme.

Ja šajā objektā mikrobioloģiskie pētījumi netiek veikti, savāktais diagnostikas materiāls jāievada laboratorijā centralizēti ar nosacījumu, ka materiāls tiek saglabāts intervālos starp piegādēm ledusskapī vai konservantu lietošanu. Materiālu nogādājiet laboratorijā transportēšanas kastēs, kuras var viegli dezinficēt. Katram paraugam jābūt ar atbilstošu marķējumu, un visa partija jāaizpilda ar pavaddokumentu.

[29], [30], [31],

Pacientu pārbaudes veidi un biežums

Sākotnējā, tā dēvētajā diagnostikā, pacienta pārbaude tuberkulozes gadījumā ir jāpārbauda vismaz 3 krēpu porcijas 2 vai 3 dienas. Ko savāc medicīnas personāla uzraudzībā, kas palielina mikroskopijas efektivitāti.

Primāro tuberkulozes skrīningu vajadzētu veikt visām veselības aprūpes sistēmas medicīnas diagnostikas institūcijām. Nesen tika organizēti tā sauktie mikroskopijas centri, kas aprīkoti ar mūsdienu mikroskopiem un epidēmijas drošības aprīkojumu, pamatojoties uz klīniskās diagnostikas laboratorijām, lai uzlabotu sākotnējās pārbaudes efektivitāti.

Anti-TB līdzekļos tiek izmantots skrīninga tests, kas ietver krēpu izmeklēšanu vai citu diagnostikas materiālu vismaz 3 reizes 3 dienas. Ārstēšanas laikā mikrobioloģiskie pētījumi tiek veikti regulāri vismaz reizi mēnesī intensīvas ķīmijterapijas stadijas laikā. Pārejā uz ārstēšanas fāzi pētījumi tiek veikti retāk - ar intervālu 2-3 mēnešus, bet pētījuma biežums tiek samazināts līdz diviem.

Ārstnieciskās tuberkulozes diagnostikas materiāla savākšanas īpatnības

Feature patoloģiskais materiāls ar Ārpusplaušu formas TB - Mycobacterium tuberculosis zemu koncentrāciju tajā, kas prasa vairāk jutīgas metodes mikrobioloģisko pētījumu, galvenokārt uz sētu metodes vidē.

Ar urīnizvadkanāla sistēmas tuberkulozi urīns ir visatvērtīgākais mācību materiāls. Urīna savākšana jāveic speciāli apmācītam medmāsai.

Ārējās dzimumorgānus mazgā ar ūdeni ar ziepēm vai vāju kālija permanganāta šķīdumu. Urīna ārējo atveri rūpīgi attīra. Sterilā flakonā tiek savākta vidējā rīta urīna daļa: vīriešiem, protams, sievietēm, izmantojot katetru. Nieres iegurņa urīns tiek savākts sterilās mēģenēs ar kateterizāciju vienā vai divās nierēs, pēdējā gadījumā - obligāti atsevišķi no katras nieres. Nelielu šī urīna daudzumu centrifugē, nosēdumus pārbauda.

Vīriešiem, spermatozoīdu, punktveida sēklinieku, prostatas noslēpumu pakļauj centrifugēšanai, lai iegūtu nogulsnes. Ar jebkuru vīrieša dzimumorgānu apvidū noteiktā procesa lokalizāciju prostatas masāža var sekmēt sekrēciju veidošanos, kas satur mikobaktēriju tuberkulozi.

Sievietes iegūst menstruālo asiņu, sūkājot vai izmantojot Kafka vāciņu. Iegūto materiālu atbrīvo no sarkano asins šūnu, mazgājot to ar destilētu ūdeni, pēc tam centrifugējot. Nogulsnes pārbauda.

Izdalījumi no dzemdes kakla kanāla tiek savākti dažās Kafka kapacēs vai vāciņās, tas ir, ir vēlams uzkrāties 1-2 ml patoloģijas materiāla.

Materiāls, kas iegūts, operatīvi iejaucoties nierēm, dzimumorgāniem. Ar biopsijas palīdzību, noņemšana no endometrija, homogenizē. Lai to izdarītu, to ievieto sterilā javai un rūpīgi sasmalcina ar sterilām šķērēm. Šim slurry tika pievienots sterilu upes smiltīm tādā daudzumā, kas ir vienāda ar to svara, un pēc tam papildināta ar 0,5-1.0 ml izotoniska nātrija hlorīda šķīdumu, un viss tika triturated līdz pastveida masa, pievienojot nātrija hlorīda izotonisku šķīdumu (4-5 ml). Tad masai atļauts apmēram 1-1,5 minūtes, supernatants tiek pārbaudīts.

Kaulu un locītavu tuberkuloze. Punktuāls (abscesu puse), kas iegūts ar sterilu šļirci, ievieto sterilos traukos un nekavējoties nogādāts laboratorijā. Sterilā pipete, kas iepriekš samitrināta ar sterilu izotoniskā nātrija hlorīda šķīdumu, ņem 2-5 ml pusi, pārnes to pudeles lodītēs un pievieno vēl 2-3 ml izotoniskā nātrija hlorīda šķīduma. Pudele ir noslēgta ar korķi un sakrata hakeru aparātā 8-10 minūtes. Tiek analizēta homogenizētā suspensija.

Fistulējošās osteoartikulārās tuberkulozes formās tiek noņemts pūlis no fistulas. Bagātīgā izmešana tiek savākta tieši mēģenē. Gadījumos, liess pyorrhea fistula mazgā ar sterilu izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu, un mazgāšanas tika savākti mēģenē, vai gabalos, tampons, kas piesūcināts ar pus nosūtīti analīzei.

Ķirurģisko materiālu operācijas uz kauliem un locītavām laikā iegūtie var sastāvēt no strutainas-nekrotiskās masu, granulations, rētas, kaulu audu sinoviālā membrānām un citām virsmām. Tās ārstēšana tiek veikta, tāpat kā nieru tuberkuloze.

Sinovilārā šķidruma mikrobioloģiskā pārbaude 3% nātrija citrāta šķīdumā (attiecība 1: 1) koagulācijas novēršanai tiek veikta tūlīt pēc perforēšanas.

Limfmezglu tuberkuloze. Tika pārbaudīts arī vingrinājums, kas iegūts limfmezglu punkcijas laikā. Kā abscesu puse. Tika pārbaudīti limfmezglu audi, kas iegūti ķirurģisku iejaukšanos, biopsijas, kā arī ar citām tuberkulozes formām.

Maltītes tuberkulozes masas masas izpēte ir ārkārtīgi reti, jo gandrīz pilnīgi trūkst pozitīvu rezultātu.

[32], [33], [34], [35], [36],

Mikobaktēriju mikroskopija

Migrēnas mikroskopija ir salīdzinoši ātra, vienkārša un lēta metode, kas jāizmanto visos gadījumos, kad ir aizdomas par tuberkulozi. Turklāt šis pētījums tiek veikts, lai novērtētu ķīmijterapijas efektivitāti un noskaidrotu ārstēšanas atjaunošanos vai neveiksmi, ja nav kultūras pārbaudes.

Tiek izmantotas divas mikroskopiskās pārbaudes metodes:

• tiešās mikroskopijas metode, ja uztriepe ir tieši sagatavota no diagnostikas materiāla;
• nogulumu mikroskopijas metode, kas iegūta no attīrītā apstrādātā materiāla kultūrai.

Pirmo metodi izmanto laboratorijās, kurās veic tikai mikroskopiskus pētījumus (vispārējā medicīnas tīkla klīniskās un diagnostikas laboratorijas).

Labākie mikroskopiskās izmeklēšanas rezultāti tiek iegūti, koncentrējot diagnostikas materiālu (piemēram, ar centrifugēšanu).

Izgudrojot mikobaktēriju tuberkulozi ar varbūtību 50%, veicot mikroskopu, 1 ml krēpas satur vairāk nekā 5000 mikrobu šūnas. Pacientu ar plaušu tuberkulozes formu krūtiņas parasti satur ievērojamu daudzumu skābju baktēriju, kas ļauj tos droši noteikt ar bakterioskopiju. Šīs metodes diagnostisko jutību var uzlabot, pētot vairākus viena pacienta krēpu paraugus. Negatīvs bakterioskopiskās izmeklēšanas rezultāts neizslēdz tuberkulozes diagnostiku, jo dažu pacientu krēpās ir mazāks mikobaktēriju daudzums, nekā var noteikt ar mikroskopiju. Slikta krēpu iztvaikošanas sagatavošana var izraisīt arī bakterioskopiskās izmeklēšanas negatīvu rezultātu.

Visbiežāk sastopamā metode skābju ātras mikobaktēriju noteikšanai uztriepes laikā ir krāsa saskaņā ar Tsiol-Nelsen. Metode ir balstīta uz karboliskā fuksīna iekļūšanu mikrobu šūnā caur membrānu, kas ietver vaska-lipīdu slāni, vienlaicīgi sildot un stiprinot fenola iedarbību. Pēc tam, kad uztriepes mainās ar 25% sērskābes vai 3% sālsskābes šķīdumu, mainās visas krāsvielas, kas nav skābi. Uztriepes krāsainie elementi iekrāsota ar 0,3% metilēnzilā šķīdumu. Mikobaktērijas neuztver parastās anilīna krāsvielas, kā rezultātā acidbaktiskās mikobaktērijas tiek iekrāsotas tumši sarkanā krāsā un citos mikrobos un šūnu elementos - zilā krāsā.

For uztriepes iezīmētajiem ar Ziehl-Nelsenu izmantot gaismas binokulāro mikroskopu ar eļļas imersijas lēcu (90- vai 100-kārtīgu palielinājumu) un okulārā uz 7- vai 10-kārtīgu palielinājumu. Izpētīt 100 redzes laukus, kas ir pietiekami, lai identificētu atsevišķas mikobaktērijas uztriepes. Gadījumā, ja šāda pētījuma rezultāts ir negatīvs, apstiprināšanai ieteicams skatīt vēl 200 redzamības laukus. Ierakstīt rezultātus, norādot konstatēto skābās bacilli (KUM) skaitu.

Papildus šai tehnikai krāsu fluorohromus izmanto luminiscējošai mikroskopijai, kas ļauj sasniegt labākos rezultātus. Šīs metodes izmantošana palielina mikroskopijas efektivitāti par 10-15%. Mikobaktēriju ārstēšanā ar luminiscējošām krāsvielām (auramīnu, rodamīnu uc) šīs vielas arī saistās ar mikrobu šūnu vasku līdzīgām struktūrām. Ja krāsainās šūnas apstaro ar aizraujošu gaismas avotu (noteiktu ultravioletā starojuma spektru), tās sāk mirgot ar oranžu vai spilgtu sarkanu gaismu uz melna vai tumši zaļa fona. Sakarā ar redzamā attēla lielo spilgtumu un kontrastu, mikroskopa kopējo palielinājumu var samazināt par 4-10 reižu, redzes lauks paplašinās un preparāta skatīšanās laiks samazinās. Papildus tam, pateicoties daudz plašākam lauka dziļumam, jūs varat palielināt studiju komfortu.

Ja tiek izmantota fluorescences mikroskopija, lai skatītu vienu un to pašu apgabalu, uztriepes iztērē ievērojami mazāk laika nekā ar Tsiol-Nelsen krāsas mikroskopiju. Ja darba dienā mikroskops pārbauda apmēram 20-25 šādas uztriepes, tad ar fluorescences mikroskopijas palīdzību viņš var vienlaicīgi pārbaudīt vairāk nekā 60-80 paraugu. Pieredzējuši mikroskopi zina, ka šūnu krāsa ar auramīna un rodamīna maisījumu zināmā mērā ir raksturīga skābēm bacillām, kas šajā gadījumā izskatās kā zelta spieķi. Saprofīti krāsoti zaļgani.

Vēl viena būtiska priekšrocība metodi dienasgaismas mikroskopu - spēju atklāt izmainīta Mycobacterium zaudēja reibumā nelabvēlīgiem faktoriem, tai skaitā intensīvā ķīmijterapija, kislotousotoychivosti īpašums un netiek konstatēta saistībā ar šo krāsošanu Ziehl-Nelsenu.

Fluorescences mikroskopijas metodes trūkumi ietver mikroskopa salīdzinoši augstās izmaksas un tā darbību. Tomēr centralizētās vai citās lielās laboratorijās, kur slodze pārsniedz 3 laboratorijas tehniķu normas, kuras strādā ar trim tradicionālajiem mikroskopiem, tā vietā ir lētāk izmantot vienu fluorescējošo mikroskopu.

Bakterioskopiskām metodēm ir diezgan augsta specifika (89-100%). Aptuveni 97% pozitīvu rezultātu, kas iegūti ar jebkuru mikroskopijas metodi, nepārprotami apstiprina sējas rezultāti.

Jāatzīmē, ka tad, kad mikroskopiskā patoloģiskā materiāla uztriepe tiek pārbaudīta, nav iespējams noteikt, kāda suga pieder identificētajai skābju ātrai mikobaktērijai. Mikroskopija metode ļauj sniegt atzinumu tikai par esamību vai neesamību skābes sagatavošanā mikroorganismu, ko var izskaidrot ar to, ka pastāv dabā ar lielu skaitu morfoloģiski līdzīgas tuberkulozes mikobaktēriju sarežģītu nontubercular skābes izturīgs mikroorganismiem.

Mikroskopijas rezultāti tiek novērtēti semikvantitajās vienībās.

Lai varētu salīdzināt dažādu mikroskopijas metodes rezultātus, empīriski koeficienti administrē. Piemēram, lai salīdzinātu ar uztriepes iezīmētajiem ar luminiscences krāsām rezultātus, dati pētījums gaismas mikroskopu (1000 reižu palielinājumu), tas ir nepieciešams, lai sadalīt skaitu acid-fast nūjiņām konstatējusi fluorescences mikroskopu, atbilstošais koeficients pie 250-kārtīgu palielinājumu - līdz 10., 450 reizes - līdz 4, ar 630 reizes - līdz 2.

Mikroskopijas īpašības ārējai plaušu tuberkulozei

Tiešā mikroskopija tiek veikta, kā arī pēc bagātināšanas sagatavotās uztriepes mikroskopija, kam seko Tiol-Nelsen krāsošana vai luminiscējošas krāsvielas. Uzlīmju tiešā mikroskopija ir neefektīva, jo materiālā ir neliela mikobaktēriju koncentrācija, tāpēc ir lietderīgāk izmantot bagātināšanas metodes. Visefektīvākais ir centrifugēšana. Ja bioloģiskais materiāls ir viskozs, centrifugēšana tiek piemērots ar vienlaicīgu sašķidrināšanas un homogenizācijas materiāla, kas tiek veikta, izmantojot ātrgaitas centrifūgas ar 3000 g un hipohlorīta šķīdumiem centrbēdzes spēku. Citas bagātināšanas metodes, piemēram, mikroflota, pašlaik netiek izmantotas bioloģiski bīstamu aerosolu veidošanās dēļ.

[37], [38],

Tuberkulozes diagnostikas kultūras metode

Sēšanas metode vai kultivēšanas metode ir jutīgāka nekā smēres mikroskopija, un tai ir vairākas priekšrocības salīdzinājumā ar pēdējo. Tas ļauj testa materiālā konstatēt vairākus desmitiem dzīvotspējīgu mikobaktēriju un tiem ir liela diagnostikas vērtība. Tas ir īpaši svarīgi, pārbaudot materiālu no nesen diagnosticētiem vai ārstētiem pacientiem, kuri atbrīvo nelielu daudzumu mikobaktēriju.

Salīdzinot ar mikroskopiju, kultūras pētījumi ļauj palielināt vairāk nekā 15-25% diagnozēto TB pacientu skaitu, kā arī pārbaudīt tuberkulozi agrākos posmos, kad slimība joprojām ir pakļauta ārstēšanai. Kultūras testa ļoti svarīga priekšrocība ir iespēja iegūt ierosinātāju kultūru, kuru var identificēt un izpētīt atkarībā no zāļu jutīguma, virulences un citām bioloģiskām īpašībām.

Audzēšanas metožu trūkumi ietver to ilgumu (materiālu gaidīšanas laiks sasniedz 10 nedēļas). Augstākas izmaksas, diagnostikas materiāla apstrādes sarežģītība.

Diagnostikas materiāla ārstēšanas priekšnosacījumi

Tuberkulozes pētījumu veikšanā nevar izmantot parastās mikrobioloģiskās metodes. Tas ir saistīts ar faktu. Ka mikobaktēriju tuberkuloze aug ļoti lēni, un lielākajā daļā klīnisko paraugu satur strauji augošus pērogēnus un pūtīgus mikroorganismus, sēnītes. To straujā izaugsme bagātīgo barības vielu vidē traucē mikobaktēriju attīstību un neļauj izolēt tuberkulozes izraisītāju, tādēļ diagnostikas materiāls pirms sēšanas jāpārstrādā. Turklāt mikobaktēriju, kas izdalās no pacienta elpošanas ceļiem, parasti ieskauj liels gļotu daudzums, kas apgrūtina koncentrāciju. Šajā sakarā, pirms stādīšanas krēpas un citu līdzīgu materiālu, to sašķidrināšanas, dekontaminācija ir nepieciešama.

Visiem mazgāšanas līdzekļiem un dekontaminiem vairāk vai mazāk izteikti toksiska ietekme uz mikobaktērijām. Apstrādes rezultātā līdz pat 90% mikobaktēriju var nomirt. Lai saglabātu pietiekami daudz mikobaktēriju iedzīvotāju, aiztaupot nepieciešamību izmantot apstrādes metodes, kas ļauj, no vienas puses, lai apspiestu strauji augošās pyogenic baktērijas un pretīgs, un no otras puses - saglabāt dzīvotspēju mikobaktēriju esošo materiālu.

Atkarībā no materiāla, tās pakāpi viendabīguma un piesārņojuma iepriekšēja apstrādei, izmantojot dažādus dezaktivatoru: Krēpas - 4% nātrija hidroksīda šķīdums, risinājumi trohzameschonnogo nātrija fosfāta 10%, benzalkonija hlorīds, trinātrija fosfāts, NALC-NaOH (N-acetil-L-cisteīna nātrija hidroksīds) ar galīgo koncentrāciju no 1% NaOH, urīnā un citu šķidru materiālu - sērskābes šķīduma 3%, par piesārņoto paraugiem, taukus saturošu materiālu - šķīdums skābeņskābes līdz 5%. Turklāt, dažos gadījumos, izmantot fermentus, virsmas aktīvās savienojumi (virsmas aktīvām vielām). Pieteikuma Tween mazgāšanas līdzekļi un daži citi mikobaktēriju nāve pavada mazāk šūnu (40-50% izdzīvos). Tomēr tos var izmantot tikai šķidriem materiāliem. Vislielākais izplatījums pasaulē bija NALC-NaOH. Ražots komplektos. Šī metode ļauj sadalīt vairāk nekā 85% no mikobaktēriju šūnu populācijas. Un neitralizācijas tkanesoderzhaschih cietvielas grūtāk uzminēt, jo pakāpe dispersijas materiāla sasmalcināšanas laikā grūti. Piemēram, ārstēšanas biopsijas limfmezglu bieži pavada biežāk piesārņojuma ar svešas izcelsmes floru. Šajā gadījumā var izmantot 1% etonija.

Nehomogēns materiāls tiek homogenizēts ar stikla lodītēm dezaktivatoru klātbūtnē. Šķidrie materiāli tiek iepriekš centrifugēti un apstrādā tikai nogulsnes.

Sēšanas un inkubācijas paņēmieni

Pēc pirmapstrādes materiāls tiek centrifugēts, tādējādi izgulsnējot mikobaktērijas un palielinot to saturu nogulumos ("dūņu bagātināšana"). Iegūtās nogulsnes tiek neitralizētas un inokulētas (inokulētas) ar blīvu barības vielu vai šķidruma (pusšķidra) barotnes. No pārējām nogulām, uztriepes tiek sagatavotas mikroskopiskai pārbaudei. Sēšanas tehnikai jānovērš diagnostikas materiāla savstarpēja piesārņošana.

Mikrobioloģiskā pētījuma rezultātu drošai klīniskai interpretācijai jāievēro šāds noteikums: mikroskopiskie un kultūras pētījumi jāveic paralēli no viena un tā paša diagnostikas materiāla parauga.

Inokulētās caurules horizontālā stāvoklī 2 dienas tiek ievietotas termostatā 37 ^° C temperatūrā. Tas nodrošina vienmērīgāku materiāla absorbciju barotnē. Pēc divām dienām caurules tiek pārvietotas vertikālā stāvoklī un hermētiski noslēgtas ar gumijas vai silikona kontaktdakšu, lai novērstu sējmateriāla žāvēšanu.

Labība inkubē 37 ^par C 10-12 nedēļas ar regulāru iknedēļas apskatei. Par katru priekšskatījumu tiek reģistrēti šādi parametri:

• vizuāli novērojamais periods no sēšanas gada;
• augšanas ātrums (CFU skaits);
• augu piesārņojums ar svešas izcelsmes mikroorganismu floru vai sēnītēm (šādas caurules tiek noņemtas);
• redzamas izaugsmes trūkums. Caurules tiek atstātas termostatā līdz nākamajai apskatei.

Barības vielas

Mikobaktēriju audzēšanai tiek izmantoti dažādi barības vielu veidi; blīvs, pusšķidrs, šķidrs. Tomēr neviens no zināmajiem barības vielu vidē nesatur īpašības, kas nodrošinātu visu mikobaktēriju šūnu augšanu. Saistībā ar to ieteicams izmantot 2-3 dažāda sastāva barības vielas ar vienlaicīgu lietošanu, lai palielinātu efektivitāti.

PVO iesaka Levenstein-Jensen vidi kā standarta barotni primārajai tuberkulozes izraisītāja izdalīšanai un zāļu jutīguma noteikšanai. Šī ir blīva olšūnu vide, kurā mikobaktēriju augšana tiek iegūta 20.-25. Dienā pēc bakterioskopiski pozitīva materiāla sēšanas. Bakterioskopiski negatīvā materiāla kultūrām nepieciešams ilgāks inkubācijas periods (līdz 10-12 nedēļām).

Mūsu valstī ierosinātā E.R. Somu olu vīns Finn-II. Tas atšķiras ar to, ka L-asparagīna vietā tā izmanto nātrija glutamātu, kas izraisa citus mikobaktēriju aminoskābju sintezēšanas veidus. Pieaugums šajā vidē parādās nedaudz agrāk, un mikobaktēriju piešķiršanas biežums ir 6-8% lielāks nekā Lowenstein-Jensen vidē.

Lai uzlabotu ekstrapolētās tuberkulozes bakterioloģiskās diagnozes efektivitāti, ir ieteicams iekļaut modificēto somiņa II mediju uzturvielu barotnes kompleksā. Lai paātrinātu augšanu, Finn-II barības vielai papildus pievieno 0,05% nātrija tioglikolāta, kas samazina skābekļa koncentrāciju. Lai aizsargātu mikobaktēriju fermentu sistēmas no toksiskajiem lipīdu peroksidēšanas produktiem Som-II uzturvielu barotnē, pievieno antioksidantu α-tokoferola acetātu koncentrācijā 0,001 μg / ml. Diagnostikas materiāla sēšana tiek veikta saskaņā ar standarta procedūru.

Krievijas anti-tuberkulozes laboratorijās tiek izmantotas arī citas biezu barības vielu masas izmaiņas; ierosināja G. G. Mordovijas uzturvielu barotne "Jaunais", ko izstrādājusi V.A. Anicic barības vielu mediji A-6 un A-9 utt.

Sakarā ar to, ka šajā procesā ķīmijterapijas ir bojājumi dažādām vielmaiņas sistēmās mikrobu šūnas, daži mikobaktēriju iedzīvotāji zaudē spēju normāli attīstīties parasto barotnē un prasa osmotiski līdzsvarotu (vai daļēji šķidrums) barotnes.

Diagnostikas materiāla sēšanas rezultātu novērtēšana un reģistrēšana

Daži mikobaktēriju celmi un sugas aug lēni, augšana var parādīties pat 90. Dienā. Šādu kultūru skaits ir mazs, bet tas ļauj izturēt kultūru termostatā 2,5-3 mēnešus.

Mycobacterium tuberculosis virulentu kultūra parasti aug blīvu olu vidē dažādu izmēru un sugu R formas koloniju veidā. Kolonijas ir sausas, grumbotas, ziloņkaula, nedaudz pigmenti. Citos medikamentos mikobaktēriju tuberkulozes kolonija var būt mitrāka. Pēc ķīmijterapijas kursa vai ārstēšanas laikā var iedalīt gludas kolonijas ar mitru augšanu (S formas).

Izolējot kultūru, tiek izmantots speciālu pētījumu kopums, lai atšķirtu mikobaktēriju tuberkulozi no ne-tuberkulozes mikobaktērijām un skābes izturīgiem saprofītiem.

Pozitīva atbilde tiek dota pēc obligātās mikroskopiskās pārbaudītās krāsainās Tsiol-Nelsen uztriepes no audzētajām kolonijām. Attiecībā uz mikobaktēriju augšanu uz uztriepes tiek konstatēti spilgti sarkanie nūjiņas, kas atrodas atsevišķi vai grupās, kas veido filcs vai pītes. Ar jauniem kultūru, jo īpaši izolēti no ilgstošas ārstēšanas pacientiem ar ķīmijterapiju, mikobaktērijas atšķiras pausto polimorfisms līdz klātbūtnē stieņa formas, kopā ar īsu, gandrīz coccoid vai iegarenas versijas, kas līdzinās micēlijs.

Mikobaktēriju augšanas ātrumu norāda ar šādu shēmu: (+) - 1-20 cfu in vitro (mazs baktēriju izdalīšanās); (++) - 20-100 CFU in vitro (mērena bakteriāla izdalīšanās); (+++) -> 100 CFU in vitro (bagātīga baktēriju ekskrēcija). Laboratoriskajā tuberkulozes diagnostikā nav pietiekami, lai atbildētu, vai mikobaktēriju nosaka ar vienu vai otru metodi. Ir detalizēta izpratne par mikobakteru populācijas apjomu un raksturu, tā sastāvu un īpašībām. Šie dati ļauj mums pareizi interpretēt procesa stāvokli, plānošanas taktiku un savlaicīgi koriģēt ārstēšanu.

Pēdējos gados, lai paātrinātu mikobaktēriju augšanu, ir ierosināts uzturvielu barotnes uz agara pamata ar dažādām augšanas piedevām un īpaša gāzes maisījuma izmantošanu. Lai iegūtu mikobaktēriju augšanu šajos barotnēs, kultivēšanas laikā tiek radīta atmosfēra ar lielu oglekļa dioksīda saturu (4-7%). Šim nolūkam tiek izmantoti speciāli CO ₂ -inkubatori. Tomēr visattīstītākās automatizētās sistēmas mikobaktēriju audzēšanai: MGIT-BACTEC-960 un MB / Bact.

Viena tāda sistēma - MGIT sistēma (mikobaktēriju pieaugums norādot caurule), kas attiecas uz attīstību, augsto tehnoloģiju, un ir paredzēts, lai ātri bakterioloģisko diagnostiku tuberkulozes un Mycobacterium jutība pret pirmās rindas medikamentiem, un daži otrās rindas zālēm. MGIT koncentrējas uz tā izmantošanu kā daļu no VASTES-960 ierīces. Mikroorganismus audzē īpašās caurulēs ar šķidru barības vielu, pamatojoties uz modificēto Middlebrook-7H9 barotni. Lai stimulētu mikobaktēriju augšanu un novērstu svešas izcelsmes mikrofloras augšanu, tiek izmantots MGIT augšanas papildinājums un PANTA antibakteriālo līdzekļu maisījums.

Mikroorganismu augšana tiek ierakstīta optiski. Tā ir balstīta uz fluorescences kas rodas, kad skābekļa patēriņš Mycobacterium mi augšanas laikā. Oxygen-flyuorohromny krāsviela ietverts apakšā īpašu test tubes un pārklāti ar slāni silikonu. Pavairošana mikobaktēriju noved pie samazināšanos skābekļa daudzumu ar cauruli un samazinot koncentrāciju, kas izraisa fluorescenci pieaugumu, kas kļūst redzamas apstarošanai ultravioleto gaismas lampas un automātiski reģistrē fotosensori iebūvēto iekārtu VASTES-960. Luminiscences intensitāti reģistrē izaugsmes vienībās (GU pieauguma vienības). Izaugsmes dati tiek reģistrēti datorā, kur tos var automātiski saglabāt. Datorizētā analīze augšanas līkņu var sniegt informāciju par klātbūtni dažādu Mycobacterium baseini, ieskaitot nontubercular, kā arī palīdz izvērtēt izaugsmes īpašības mikobaktēriju.

Šo sistēmu ieviešanas rezultātā mikobaktēriju augšanas laiks ievērojami samazinājās, vidēji 11 dienas VASTES-960 un 19 dienas uz MB / Bact, salīdzinot ar 33 dienām, uz standarta blīvu barības vielu. Jāatzīmē, ka šīm sistēmām ir nepieciešams augsti kvalificēts personāls. Sējmašīnas materiāls likvīdo līdzekļu tiks pavadībā sējas Lowenstein-Jensen vidē, spēlējot lomu dublieris gadījumos, kad citi mediji Mycobacterium tuberculosis neļauj izaugsmi.

[39], [40], [41], [42], [43], [44],

Mikobaktēriju jutīguma pret narkotikām noteikšana

Mikobaktēriju spektra un jutīguma līmeņa noteikšana pret tuberkulozes līdzekļiem ir ļoti nozīmīga klīniska nozīme, kā arī tuberkulozes izplatīšanās ar zāļu izturību epidemioloģiskais novērtējums. Turklāt zāļu rezistences kontrole ļauj novērtēt tuberkulozes programmas efektivitāti kopumā, kas ir neatņemama visu prettuberkulozes darbību sastāvdaļu efektivitātes rādītājs.

Zāļu jutīguma daudzveidība un laiks:

• pirms ārstēšanas sākuma, lai noteiktu ārstēšanas stratēģiju un taktiku:
• kad tiek izolēti no dažādām vielām no slimām kultūrām (krēpas, BAL šķidrums, urīns, eksudāti, šķidrumi utt.), tiek pārbaudīti visi izolētie celmi:
• intensīvas ārstēšanas fāzes beigās, ja nav klīniskās un radioloģiskās dinamikas:
• ja ir nepieciešams mainīt ārstēšanas režīmu šādos gadījumos:
  • krēpu masas trūkums;
  • kultūras atkārtota izolēšana pēc negatīvas uztriešanas;
  • krasais CMU skaita palielinājums tupelī pēc sākotnējā samazinājuma. Ir labi zināms, ka no tuberkulozes pacienta materiāla tiek izolēti mikobaktēriju tuberkulozes celmi, kas ir neviendabīgi ar zāļu jutīgumu. Celmu jutība pret prettuberkulozes medikamentiem var atšķirties zāļu spektrā, rezistences rašanās pakāpe, biežums un ātrums.

Mycobacterium tuberculosis zāļu izturības pakāpe tiek noteikta atbilstoši noteiktajiem kritērijiem, kuri orientēti uz rezistences klīnisko nozīmīgumu, un ir atkarīgi no zāļu prettunģulārās aktivitātes, tās farmakokinētikas, koncentrācijas bojājuma koncentrācijā. Maksimālā terapeitiskā deva utt.

Mikobaktēriju jutīguma pret narkotikām noteikšana pašlaik tiek veikta ar mikrobioloģiskām metodēm:

• Absolūtās koncentrācijas (atšķaidīšanas metode uz blīvu vai šķidru barības vielu vidē),
• proporcijas
• pretestības koeficients.

Parasti stabilitāte izpaužas kā vizuāli novērojamu koloniju augšanu Mycobacterium tuberculosis, bet ir metodes, kas izraisa sākumposmā izaugsmes dalot šūnām Mycobacterium formā krāsu reakciju. Šīs metodes saīsina pārbaudes laiku no 3-4 līdz 2 nedēļām.

Kā vienota Krievijā ir pagarināts, ko PVO komitejas ķīmijterapijas metodi absolūto koncentrāciju, kas ir no metodoloģiskā viedokļa ieteicams ir visvienkāršākā, bet tā prasa augstu precizitāti un standartizāciju laboratorijas procedūras. DST sastāv no kopuma cauruļu ar barojošā vidē, modificēto anti-TB zāļu. Komplekts sastāv no 2-3 caurules ar dažādām koncentrācijām katrs no zālēm, ko izmanto, viens kontroles mēģenēs bez šī medikamenta uz vidi un ar vienu caurule kas satur 1000 mcg / ml nātrija Sali tsilovokislogo vai 500 ug / ml paranitrobenzoynoy skābes nontubercular, lai noteiktu augšanu mikobaktēriju.

Lai sagatavotu medikamentu komplektu ar preparātiem, tiek izmantota modificēta Levenstein-Jensen barotne (bez cietes), kas tiek ielejama kolbās. Katrā kolbā pievieno īpašu prettriebušā preparāta atšķaidījuma apjomu. Kolbu saturs rūpīgi sajauc, ielej mēģenēs un noliekts uz leju 40 minūtes 85 ° C temperatūrā. Ir ieteicams spolēts barotni ar elektrisko pārtinatoru ar automātisku temperatūras kontroli. Trešdien ar anti-TB medikamentiem

1 sēriju var uzglabāt ledusskapī 2-4 ° C temperatūrā 1 mēnesi, otrās rindas preparātus - ne vairāk kā 2 nedēļas. Mediju uzglabāšana ar preparātiem istabas temperatūrā ir nepieņemama. Sagatavojot anti-tuberkulozes zāļu risinājumus, tiek ņemta vērā to aktivitāte, aprēķinot koncentrāciju, kas pielāgota preparāta neskīstošās daļas molekulmasai, tīrība utt. Lai noteiktu zāļu jutīgumu, tiek izmantotas tikai ķīmiski tīras vielas.

Metodes princips ir noteikt prettuberkulozes zāles koncentrāciju, kas kavē ievērojamas mikobakteru populācijas pieaugumu. Ja tas tiek izdarīts pareizi, šai metodei ir laba ticamība.

Pirms testa ir jāpārliecinās, ka izolētajā mikobaktēriju tuberkulozes kultūrā nav svešas mikrofloras. No mikobaktēriju kultūras 0,9% nātrija hlorīda šķīdumā sagatavo homogēnu suspensiju, kas satur 500 miljonus mikrobu vienību mililitrā (optiskā duļķainuma standarts ir 5 vienības). Iegūtā virca tiek atšķaidīta ar 0,9% nātrija hlorīda šķīdumu (1: 10), un katrā kultūru barotnes mēģenē pievieno 0,2 ml vircas. Sēklas caurules ievieto termostatā 37 ° C temperatūrā un tiek turētas horizontālā stāvoklī 2-3 dienas, lai kultivētās barības slīpā virsma vienmērīgi tiktu inokulēta ar mikobaktērijas tuberkulozes suspensiju. Tad caurules tiek pārvietotas vertikālā stāvoklī un inkubē 3-4 nedēļas. Rezultāti tiek reģistrēti pēc 3-4 nedēļām.

Tā kā eklekcijas izdalīšanās laiks no klīniskā materiāla par uzturvielu barotni ir vismaz 1-1,5 mēneši, zāļu jutīguma noteikšanas rezultātus ar šo metodi var iegūt ne agrāk kā 2-2,5 mēnešus pēc materiāla sēšanas. Šis ir viens no galvenajiem metodes trūkumiem.

Interpretēt mikobaktēriju jutīguma noteikšanas rezultātus, pamatojoties uz noteiktiem kritērijiem. Uz cietā barotnēm tiek uzskatīti par nevēlamiem koncentrācijai narkotiku, kas ir ietverti šajā vidē, ja skaits koloniju mikobaktēriju kultūrās in vitro ar šo narkotiku, ir ne vairāk kā 20 ar bagātīgu izaugsmi kontroles caurulē bez narkotikām. Tikai vairāk nekā 20 koloniju klātbūtnē kultūra tiek uzskatīta par izturīgu pret šo koncentrāciju. Praksē, iegūstot augšanu, testa caurulītes sasniedz 20 cfu. Ir jāpaziņo klīniskajai vienībai, ka šajā gadījumā jutīgums vai pretestība ir robežstabils, jo reizēm tas var izskaidrot klīnisko indikatoru izplūdušo dinamiku.

Dažādiem medikamentiem tiek noteikta noteikta koncentrācija, kurā tiek novērota mikobakteru populācijas kritiskās daļas reprodukcija. Šīs koncentrācijas sauc par "kritiskām". Kā stabilitātes kritērijs tiek izmantots mikobaktēriju populācijas pieaugums uzturvielu barotnē ar preparātu kritiskā koncentrācijā.

Tiešsaistes tuberkulozes praksē, nosakot zāļu rezistenci, tās neaprobežojas tikai ar kritisko koncentrāciju noteikšanu. Tas ir saistīts ar faktu. Ka paplašinātā definīcija līmenis zāļu rezistences ļauj ārstam precīzāk pozicionēt taktika ķīmijterapiju, izmantojot zināšanas potencēšanai rīcību narkotiku kombināciju, CrissCross paredzamo izturību vai piemērot efektīvākas zāles grupu izmanto anti-TB narkotikas.

Absolūtais koncentrācijas metode ir visvienkāršākā, bet tā ir arī visjutīgākā pret kļūdām, kas tiek veiktas, veicot to. Paaugstināta ticamība, jo īpaši, nosakot jūtīgumu pret otrās rindas zālēm un izplatītām ārpus Krievijas, ir proporciju metode. Tajā ņemti vērā absolūtās koncentrācijas metodes nepilnības, bet to izpilde ir daudz grūtāka.

Metode ir ļoti līdzīga absolūtās koncentrācijas metodei. Testa mēģenju sagatavošana ar medikamentiem tiek veikta tādā pašā veidā. Kā absolūtās koncentrācijas metodē. Tomēr Mycobacterium tuberculosis suspensijas sēklu deva tiek samazināta par koeficientu 10. Kas novērš dažu Mycobacterium tuberculosis celmu spontāno rezistenci pret tādām zālēm kā etambutols, protionamīds, kapreomicīns. Kā kontrole, tiek izmantotas 2 vai 3 caurules ar sēklu devu, kas ir vienāda testu mēģenēs, secīgi atšķaidīta 10 un 100 reizes. Stabilitātes kritērijs ir vizuāli novērotais mikobaktēriju tuberkulozes pieaugums. Pirmās sērijas narkotikām stabilitātes kritērijs ir pieauguma pārsniegums par 1% no sākotnējās populācijas, otrās rindas narkotikām - palielinājums par 1 vai vairāk par 10% no sākotnējās, atkarībā no izvēlētās kritiskās koncentrācijas.

1997. Gadā darba grupa PVO un Starptautiskās savienības identifikācijas laba tuberkulozes TB rezistence pret zālēm ir veikusi korekcijas šiem kritērijiem, piedāvājot uzskatīta izturīgu mikobaktērijas, kas aug uz cieta ola mediju Lowenstein-Jensen pie šādām koncentrācijām:

• dihidrostreptomicīns - 4 μg / ml;
• izoniazīds 0,2 μg / ml:
• rifampicīns 40 μg / ml:
• Etambutols - 2 μg / ml.

2001. Gadā kritiskās koncentrācijas tika piedāvātas šādām otrās rindas zālēm (kritiskā 1% daļa):

• kapreomicīns - 40 μg / ml;
• protionamīds - 40 μg / ml;
• kanamicīns - 30 μg / ml;
• viomicīns - 30 mkg / ml;
• cikloserīns 40 μg / ml;
• aminosalicilskābe - 0,5 μg / ml;
• ofloksacīns - 2 μg / ml.

Izaugsmes rezultātus vērtē pēc 4 nedēļām kā iepriekšēju un pēc 6 nedēļām audzēšanas - kā pēdējo.

Lai noteiktu zāļu jutību pret pirazinamīdu, ko plaši izmanto mūsdienu tuberkulozes ķīmijterapijā, ieteicamā kritiskā koncentrācija ir 200 μg / ml. Tomēr joprojām nav vispārpieņemtas metodes zāļu izturības pret šo zāļu noteikšanai cietajos barotnēs, jo tās antibakteriālā aktivitāte izpaužas tikai skābā vidē (pH <6), kas tehniski ir grūti noturēt. Turklāt daudzas mikobaktēriju tuberkulozes klīniskās kultūras negribīgi aug uz olu vidēm ar skābu vidi.

Lai novērtētu ar narkotiku jutīguma pārbaužu Mycobacterium rezultātu kvalitāti, ieteicams, ka katru jaunu partiju vidēja LJ kontrolē paralēli noteikšanu jutīgumu standarta muzeja celma H37Rv. Turklāt ir noteikti mikrobioloģiskie kritēriji, kas jāuztur, lai metodes būtu labi reproducējams un pareizi interpretējams. Tie ietver dzīvotspēju kultūras Mycobacterium tuberculosis, to iegūšanas noteikumus homogēnu suspensiju un suspenzijas kultūru atlases noteikumu Mycobacterium tuberculosis, reprezentativitāti izvēlētā baktēriju masas. Zāļu rezistences noteikšanas ticamība samazinās ar ļoti mazu baktēriju noplūdi.

Nesen tika uzskatīta par daudzsološu zāļu jutīguma noteikšanas metodi, izmantojot automatizētas sistēmas. Šajā jomā vislabākie ir notikumi, kas balstīti uz VASTES MGIT-960. Šajā gadījumā mikobaktēriju tuberkulozes preparātu jutīgumu nosaka, pamatojoties uz modificētu proporciju metodi. Mērķa noteikšanas laikā salīdzina mycobacterium tuberculosis augšanas ātrumu kontroles mēģenē un mēģenēs ar narkotikām. Lai noteiktu jutību pret streptomicīnu, izoniazīdu, rifamp-picīnu un etambutolu, tiek izmantoti bagātināšanas papildinājumi un antibiotikas, kas iekļautas SIRE komplektā. Lai noteiktu jutību pret pirazinamīdu, izmantojiet PZA komplektu. In gaitā suspensijas tests Mycobacterium tuberculosis inokulē mēģenēs ar zālēm, kā arī kontroles mēģenēs ar izšķīdinātā suspensija 100 reizes attiecībā uz visām narkotikām, izņemot pyrazinamide, pie kam suspensija ir atšķaidīšana 10 reizes. Stabilitātes kritērijs ir mikobaktēriju augšanas indikators 100 GU, kad audzēšanas mēģenē 400 GU tiek sasniegts augšanas ātrums (skat. "Kultūras metodes mikobaktēriju izolēšanai"). Rezultātu uzskaite un interpretācija tiek veikta automātiski, un tos nosaka ieguldījums vai izvēlēta programma.

Kā kritiskās koncentrācijas, galīgo koncentrāciju izmanto mēģenē ar šķidru barības vielu. Pašlaik kritiskās koncentrācijas ir izstrādātas gan pirmās, gan otrās rindas zālēm. Jāatzīmē, ka mikobaktēriju tuberkulozes jutīgums pret cikloserīnu un aminosalicilskābi tiek noteikts tikai olu barības vielu vidē.

Izstrādāt darba protokols aprakstītā sistēma ļauj pētīt narkotiku jutīgumu kā veltīta kultūras (blīvs barotnei), un, izmantojot primāro Mycobacterium MGIT-augšanu in vitro. Pēdējais variants ievērojami samazina laiku, kultūrai, kas ļauj jums, lai iegūtu pilnus rezultātus no kultūras Mycobacterium tuberculosis (tostarp informācija par narkotiku jutību) pēc 3 nedēļām no dienas, kad kolekcijas materiāla, bet tradicionālā metode ir iespējams iegūt tikai 3. Mēnesi. Laika gaitā iegūtie rezultāti, kad pacients atrodas intensīvā ārstēšanas fāzē, var kompensēt relatīvi augstās izpētes izmaksas.

[45], [46], [47], [48], [49], [50], [51],

Mikobaktēriju diferenciācija

Ņemot vērā, ka izmantotie barības vielu veidi nav stingri selektīvi. Izolēto mikobaktēriju diferenciācija tiek atzīta par obligātu. Nepieciešamība pēc diferenciācijas mikobaktēriju ir saistīts ar vairākiem iezīmes patoloģiskiem procesiem, ko izraisa ģints: dažādu kursu un rezultātiem tuberkulozes un mycobacteriosis, klātbūtne dabisko zāļu rezistences dažu anti-TB zāļu.

Tiek atzīts, ka primārā identifikācija Mycobacterium tuberculosis kompleksa M. Nontubercular mikobaktērijas veic ar šādiem raksturlielumiem: pieauguma temps uz cietā barotnē, pigmentācija, koloniju morfoloģijas, klātesot skābes izturība un temperatūras optimālu augšanu.

Diemžēl, nav vienas laboratorijas metode droši atšķirt M. Tuberculosis kompleksa mikobaktēriju no otras skābi izturīgu baciļu, tomēr no iepriekš aprakstītajām ar dotajiem turpmāk no vairākiem bioķīmisko testu rezultātu kombinācija funkcijas ļauj identificēt Mycobacterium tuberculosis kompleksa ar M. Iespējams 95%.

Lai nošķirtu Mycobacterium sarežģītu M. Tuberculosis (M. Tuberculosis, M. Bovis, M. BovisBCG, M. Africanum, M. Microti, M. Canettii un citi) no lēni augošā mikobaktēriju izmanto nontubercular pamata bioķīmiskās analīzes, kas noteiktu klātbūtni šādiem simptomiem:

• spēja ražot nikotīnskābi (niacīns tests):
• nitrātu reduktāzes aktivitāte;
• termostatabilā katalāze;
• augšana vidē ar nātrija salicilātu (1 mg / ml).

Kā papildu testus var izmantot arī augšanu vidē, kurā ir 500 μg / ml paranitrobenzoskābes vai 5% nātrija hlorīda.

Daudzas bakterioloģiskās laboratorijas identificē šos mikroorganismus tikai kompleksa līmenī, kas saistīts ar laboratoriju ierobežoto spēju un speciālistu metodoloģisko spēju.

Vairumā gadījumu, tomēr, praksē, lai atšķirtu M. Tuberculosis un M. Bovis, ir pietiekams šādus testus: niacīns, klātbūtnes nitrāta, klātbūtnes reģistrāciju un pirazinamidazy pieaugumu barotni, kas satur 2 ug / ml hidrazīda tiofēna-2-karbonskābes. Ņem vērā, ka M. Tuberculosis kompleksa mikobaktērijas raksturo šādas rakstzīmju kopums:

• lēna augšana (vairāk nekā 3 nedēļas);
• augšanas temperatūra diapazonā 35-37 ^o C;
• pigmentācijas trūkums (ziloņkaula krāsa);
• iezīmēta skābena un ātra krāsa;
• pozitīvs niacīna tests;
• pozitīvs nitrātu reduktāzes tests;
• termostabilas katalāzes (68 ^° C) trūkums .
• Izaugsmes trūkums Levenstein-Jensen vidē, kas satur:
  • 1000 μg / ml nātrija salicilāta,
  • 500 μg / ml paranitrobenzoskābes,
  • 5% nātrija hlorīds:
• izaugsme 1-5 μg / ml tiofen-2-karbonskābes klātbūtnē.

Atsevišķu mikobaktēriju diferenciācijas nozīmīgums ievērojami palielināsies, palielinoties ar tuberkulozi vai mikobakteriozi saistītu HIV / AIDS gadījumu reģistrēšanas biežumu. Pašlaik nav absolūtas pārliecības par praktisko reģionālo laboratoriju gatavību pareizi veikt šo darba apjomu.

[52], [53], [54], [55], [56], [57], [58], [59]

Tuberkulozes imunoloģiskā diagnostika

Pastāv virkne universālu parādību, narkotiku un imunoloģisko testu, kas sākotnēji tika atklāti tieši ar tuberkulozi vai pēc mikobaktēriju imūnās atbildes modeļa. Tie ietver BCG tuberkulīnam, šāda parādība kā ādas DTH (tuberkulīnam - Pirquet un Mantoux reakcija), reakcija uz zemādas tuberkulīna gaismjutīgas dzīvniekiem (Koch parādība). Tuberkulozes laikā tika konstatēta arī viena no pirmajām infekcijas slimību antivielām. Protams, dziļāka izpratne par labu tuberkulozes imunitātes mehānismu un to ģenētisko kontroli, jo lielāka var būt lietošana imunoloģisko metožu un zālēm, kas ietekmē imūnsistēmu, lai risinātu praktiskas problēmas TB.

Pašlaik vissvarīgākā un sarežģītā praktiskā problēma ir tuberkulozes atklāšana iedzīvotāju masas skrīnings. Tomēr, neskatoties uz daudzajiem ziņojumiem par "panākumiem" (ierobežotā materiālā), nav piemērotas imunoloģiskās metodes (atveidojamas ar "jebkādiem ieročiem") un šim nolūkam piemērotu zāļu.

Klīniskajā praksē ļoti plaši tiek izmantotas imunoloģiskās metodes, jo īpaši seroloģiskie pētījumi (antigēnu, antivielu noteikšana) un tuberkulīna izraisošie testi.

Starp diferenciāldiagnozē izmantotajiem imunoloģiskajiem pētījumiem visbiežāk tiek izmantotas seroloģiskas metodes - antigēnu un antivielu noteikšana dažādās ķermeņa vidēs.

Antivielu specifika pret mikobaktēriju tuberkulozi ir atkarīga no imūnanalīzē izmantotajiem antigēniem. Ir ierosināts ievērojams daudzums antigēnu, no kuriem pirmais ir tuberkulīna PPD:

• PAP un citi kompleksie preparāti no kultūras šķidruma;
• ultraskaņas dezintegrācija;
• Tritona ekstrakts un citi kompleksie preparāti no šūnu sienām;
• 5 antigēns (Daniels);
• 60 antigēns (Coccito);
• lipoarabinomannan;
• vadu faktors (trehalozes-6,6-di-mikolaāts);
• fenols un citi glikolipīdi;
• lipopolisaharīdi;
• fibronektīnu saistošais antigēns;
• olbaltumvielas (visbiežāk rekombinantā); 81,65,38,34,30,19,18,16,15,12 CDA uc

Kā rezultātā daudzu gadu pētījumu, ko Krievijas un ārvalstu zinātnieki atklāja pamatlikumus un efektivitāti antivielu seroloģiskajai diagnozei tuberkulozes: sarežģītāku antigēnu, augstāku jutību un zemākas specifiskumu testu. Specifika dažādās valstīs atšķiras atkarībā no iedzīvotāju M. Tuberculosis infekcijas un nontubercular mikobaktēriju, veikt BCG vakcīna, un citi. Bērniem, informācijas saturs serodiagnosis ir zemāks nekā pieaugušajiem. Primārajā tuberkulozes (biežāk bērniem) IgM definīcija ir daudz informatīvāka. Ar sekundāru IgG. Ar HIV inficētiem pacientiem antivielu noteikšanā tiek samazināta serodiagnostica informatīvā vērtība. Efektivitāte noteikšana no antivielām ir atkarīgs no vairākiem "klīnisko aspekti": process aktivitāte (esamība vai neesamība, no "izolēšana" mikobaktērijas klātbūtni sabrukšanas dobumu pakāpe infiltrācijas) prevalence procesa ilgumu tā plūsmas.

Enzīmu imunoloģiskās analīzes metodes (ELISA) jutība ir aptuveni 70%. Pietiekama pētījuma efektivitāte ir saistīta ar tās zemo specifiku. Iepriekš tika apsvērta iespēja izmantot seroloģisko skrīningu augsta riska grupās, jo īpaši personām ar post-tuberkulozes pārmaiņām plaušās.

Lai uzlabotu specifiku ELISA turpināt meklēšanu konkrētākiem antigēniem, tostarp gēnu inženierijas produkts: (sk. Iepriekš) ESAT-6, un citi .. Stingri specifisku antigēnu lietošana (38 kDa, ESAT) palielina specifiskumu. Bet ievērojami samazina analīzes jutīgumu. Kopā ar IFA (eksperimentālās laboratorijas testēšanas sistēmu. Piem Pathozyme ELISA komplektu) piedāvā arī komplekti ar sānu immunochromatographic filtrēšanu (Mycodot), kā arī citu līdzīgu testu (dot-analīzes uz membrānu) ar vizuālo novērtējumu testa rezultātu. Šo testu laikā analīze tiek veikta 10-30 minūtes; viņiem nav nepieciešamas speciālas iekārtas, viņiem ir nepieciešams vizuāls rezultātu novērtējums, kas ir saistīts ar noteiktu subjektivitāti. Šīm metodēm ir aptuveni tādas pašas jutības un specifiskās īpašības (attiecīgi 70% un 90-93%) kā tradicionālo ELISA.

Imūnanalīzes metožu izmantošanai ir noteikta vērtība kā papildus, kas ņemta vērā izmantoto metožu kompleksā tuberkulozes diferenciāldiagnozē, jo īpaši ārkārtas formu diagnostikā. Visefektīvākā ELISA metode ir tuberkulozes meningīta diagnosticēšana cerebrospināla šķidruma pētījumā. Šajā gadījumā analīzes jutīgums ir 80-85%, un specifiskums ir 97-98%. Ir dati par mikobaktēriju tuberkulozes antivielu noteikšanas efektivitāti asaru šķidrumā tuberkulozā uveīta diagnozē.

Gamma interferona sintēzes indukcija in vitro

Gamma interferons (IFN-γ) ir specifisks imūnreakcijas faktors, kas tiek realizēts, aktivējot makrofāgu enzīmu sistēmas. IFN-γ sintēzes indukcija ar sensibilizētiem T-limfocītiem izraisa to mijiedarbību ar mikobaktēriju antigēniem.

Kā antigēni lieto kā tuberkulīna PPD. Un specifiskās antigēniem, kas iegūtas ar gēnu inženierijas, jo īpaši antigēniem ESAT-6 (sākumā izdala antigēnu, kam ir molekulmasa 6 kDa) un CFP-10 (kultūra filtrāts olbaltumvielu 10 kDa). BCG vakcīnas un citu mikobaktēriju šūnās nav ģenētiskās inženierijas vai rekombinanto antigēnu. Izmantojot tuberkulīnu, indukcijas testa IFN-γ rezultāti ir salīdzināmi ar tuberkulīna ādas testa rezultātiem (tiešā korelācija). Izmantojot ģenētiski konstruētus antigēnus, testa rezultāti ir specifiskāki un nav atkarīgi no iepriekšējās BCG vakcinācijas. Pārbaudot vakcinētas personas, kurām nav saskares ar tuberkulozes infekciju, testa specifika ir 99%. Testa jutīgums pacientiem ar tuberkulozi svārstās no 81 līdz 89%.

Testi un diagnostikas instrumenti ir izstrādāts, pamatojoties uz īslaicīgai audzēšanai šūnu vai asins mononukleāriem izolēti no asinīm ar antigēnu Mycobacterium tuberculosis in vitro ar sekojošu noteikšanai IFN-gamma koncentrāciju vai ar saskaitot T-limfocītu, kas sintezēt IFN-gamma. Testa mēģenē sintezētā interferona koncentrāciju nosaka ar ELISA, izmantojot IFN-γ saistošas monoklonālās antivielas. Pēc tam, kalibrējot standarta IFN-γ, tā koncentrāciju nosaka plāksnes mēģenē vai caurulēs.

Veicot Elispot testu, T-limocītu skaits, kas sintezē IFN-γ. Tiek uzskaitīti uz plāksnes virsmas, kas pārklāta ar antivielām pret IFN-γ.

Izstrādātāji Diagnosticum par IFN-γ in vitro, izmantojot indukcijas, kas apstiprina aģentūras Zāļu un ASV produktiem, apgalvo, ka tests ir iespējams atšķirt latento tuberkulozes infekciju no aktīvas tuberkulozes. Tāpēc reģionos ar augstu infekcijas līmeni tests nav tieši diagnosticēts. Tomēr mūsu valstī to var izmantot, lai diferencētu tuberkulozes infekciju bērniem pēc vakcinācijas pret alerģiju un novērtētu specifiskās imunitātes līmeni ārstēšanas procesā.

Pašlaik tiek pētīta iekšējā testēšanas sistēma, lai noteiktu IFN-γ sintēzes indukciju ar īpašām tuberkulozes antigēnām in vitro.

Imūnsistēmas stāvoklis un tuberkulozes gaita, imūnkorekcija

Cilvēku tuberkulozes ārstēšanas procesā ir izmaiņas antigēnēmā un imūnsistēmas stāvoklī.

Dati par eksudātu un audu izmaiņām lielā mērā ir pretrunīgi. Vienīgais, ko var pamatoti uzrakstīt, ir tas, ka tuberkulozes granulomās parasti tiek konstatēts ievērojams skaits aktivēto T-limfocītu.

Ir lietderīgi apskatīt vēl divus noteikumus, kas ir nepieciešami, lai izprastu imunoloģisko mehānismu nozīmi tuberkulozes ārstēšanā cilvēkiem:

• AIDS pacientiem ir īpaši augsts vairāku zāļu rezistences sastopamības biežums;
• ar daudzu zāļu rezistenci (un bez HIV infekcijas) imunitātes traucējumi (īpaši T-šūnu saite) ir īpaši nozīmīgi.

Ja tuberkulozes plaši pielietot dažādas metodes imūnmodulācijai: tas ir galvenokārt narkotikas iedarbojas galvenokārt uz T-šūnu imunitāti, un sistēma mononukleāro fagocītu (aizkrūts dziedzera hormonus, izoforona, likopid, polioksidony et al.). Kā arī veselas (novājinātas) mikobakterijas un to sastāvdaļas.

Tuberkulozes molekulārā un bioloģiskā diagnostika

For molekulārās bioloģijas metodes diagnostikā infekcijas slimību ietver, galvenokārt, metodes, kas balstās uz manipulējot ar genoma materiāla baktēriju un vīrusu patogēniem, lai noteiktu specifisku ģenētisko materiālu - DNS segmentu, kam nukleotīdu sekvenci, kas īpaši attiecas konkrēta veida vai patogēnu celmu, lai analizētu specifisks DNS sekvences gēnos, kas nosaka patogēnu jutību pret dažām zāļu vielām, kā arī funkcionālai analīzei konkrētu patogēnu gēnu aktivitāte. Molekulārās bioloģijas metodes plaši bija zinātnisko pētījumu un praktisko pielietojumu diagnostikā un dažādu baktēriju un vīrusu infekciju uzraudzību pēc atvēršanas 1985. Gadā, Kerija Myullisom (Nobela prēmija 1989.) Polimerāzes ķēdes reakciju.

Polimerāzes ķēdes reakcijas metodes principi un iespējas

PCR ļauj miljonos reižu vairākas stundas pastiprināt (reizināt) nukleotīdu sekvenci (patogēna DNS fragmentu) in vitro. Reakcija vienas DNS ķēdes klātbūtnē nosaka ārkārtīgi augstu analīzes jutību.

Dažu DNS ķēžu reģionu nukleotīdu secība nosaka mikroorganisma ģenētisko identitāti, kas izskaidro PCR augstu specifiku.

Ar šo metodi, lai atklātu un izmeklēšanai īpašībām, ko izraisa Mycobacterium tuberkulozes bioloģiskās īpašības mikroorganismu, kam ir ļoti lēnu augšanu vērtība: dubultošanās laiku Mycobacterium tuberculosis DNS kad kultivēšana ir 12-24 stundas.

PCR metodes princips ir amplifikācija - daudzkārtēja, miljonos reižu. Reizinot konkrētas DNS sekcijas sekcijas caurules mikroviļņos, sekojošo triju reakcijas posmu cikliskā atkārtošanās reizē, no kurām katra iziet citā temperatūras režīmā:

• I posms - divvērtīgo DNS denaturēšana, uzkarsējot ar tā ķēdes diverģiju;
• II stadija - primeru (priming oligonukleotīdu) papildinoša saistīšana (hibridizācija) ar stingri specifisku ķēdes gala posmiem, izvēlēta DNS fragmenta reizināšanai;
• III posms - DNS fragmentu ķēdes pabeigšana ar termoreaktīvas DNS polimerāzes palīdzību.

In vitro amplifikācijai jābūt matricas DNS molekulām. četrējādi dezoksinukleozīdu trifosfāts (nukleotīdi), kas satur attiecīgus slāpekļa bāzēm: adenīna (A), timīns (T), guanine (G), citozīns (C); mākslīgi sintezēti priming oligonukleotīdi (praimeri), kas sastāv no 18-20 bāzes pāra; thermostable DNS polimerāze ferments kam temperatūras optimums ir 68-72 ^uz C, un magnija jonus.

PCR specifika ir atkarīga no DNS fragmenta izvēles. Saskaņā ar to sintēzes sānu sēklu oligonukleotīdus. Hibrīdizācijas un DNS ķēžu pabeigšanas specifika ir saistīta ar šādu slāpekļa bāzu pāri komplementaritātes principu: adenīntīmīns, guanīns-citozīns.

Lai noteiktu genoma tuberkulozes mikobaktēriju komplekss visefektīvākā mērķa amplifikācijas vairumā testu sistēmām izvēlēto DNS fragments no IS6110, kas lielākā daļa celmu Mycobacterium tuberculosis genomā ir ievērojams skaits (10-20) atkārtojumu, kas nodrošina, kopā ar specifiskumu, augsto jutību pret testa. Tajā pašā laikā ir aprakstītas Mycobacterium tuberculosis celmas ar nelielu skaitu atkārtojumu vai IS6110 fragments nav.

DNS molekulu izolēšana no bioloģiskā parauga

Lai veiktu PCR, patogēna DNS molekulas būtu jāizolē no bioloģiskā materiāla minimālā tilpumā ar minimālu daudzumu nonspecifiskās DNS un dažādiem enzīma DNS polimerāzes inhibitoriem.

Paraugu sagatavošana jāveic apstākļos, kas novērš paraugu savstarpēju piesārņošanu ar izolētām DNS molekulām. Lai to paveiktu, ir nepieciešams iepriekš apstrādāt telpu ar ultravioleto starojumu, grīdām un darba virsmu galdiņiem un iekārtām ar hloru saturošiem šķīdumiem. Arī automātiskajiem pipetēm ir nepieciešams lietot tīrus cimdus, vienreizējās lietošanas tvertnes un padomus.

Lai izolētu DNS Mycobacterium tuberculosis no klīniskajos paraugos (cerebrospinālā šķidruma, bronhu wash), kurā nav lielu skaitu šūnas, šūnu atliekām, vai tās sāļi, ir pietiekams, lai centrifugē paraugu 3-4 tūkstošiem. Rpm, pievienot dūņu 20-30 ul 2% šķīduma triton X-100 un silda pie 90 ^par C 30 min.

For sagatavošana no gļotām paraugiem jābūt efektīvai sašķidrināšanas, kas parasti tiek izmantots par 4% nātrija hidroksīda šķīdumu un N-acetil-L-cisteīnu (NALC) par summu 50-80 mg parauga - atkarībā no parauga viskozitāti. NALC šķīdums jāsagatavo ex tempore vai NALC pulveris var tieši pievienot žāvē paraugam. Pēc sašķidrināšanas paraugus centrifugē 15 minūtes 3,5-4,000 apgr./min. (3000 g) 50 ml flakonā ar skrūvējamu vāciņu, i. E. Ar tādiem pašiem nosacījumiem, kādi ir ieteicami flegma sagatavošanai sagatavošanai.

Ieguvei DNS no granulu metode tiek izmantota visbiežāk balstās uz izmantošanu 5-6 molāra guanidīna izotiocianāta sabrukšanas reaģentu ar mikroporaina daļiņām un silīcija oksīda ( "diatomīta zeme") sorbējošās DNS molekulu. Nonspecific vielas, ieskaitot inhibitoru iespējamo, pēc tam nomazgā ar 2.5 molāra guanidīna izotiocianātu un etanola šķīdumu, pēc kura DNS molekula desorbētais ūdenī, un šo paraugu tika izmantoti, lai veiktu PCR. Lai vienkāršotu DNS ekstrakcijas tehnoloģiju, "diatomītu" bieži aizstāj ar magnētiskām mikrodaļiņām, kas pārklātas ar silīcija oksīdu. Šajā gadījumā, lai nogulsnē daļiņas, centrifugēšanas vietā izmanto īpašu magnētisko stendu mikrotuvēm.

Krievijā tika izstrādāta oriģinālā metode mikobakteru imūnanalīzes atdalīšanai, kam sekoja patogēna DNS ekstrakcija. For Mycobacterium tuberculosis immunomagnetic atdalīšanai izmantojot ferroparticles izmēru 3-5 mkm, pārklāta ar silīcija dioksīda, kas ir saistīta ar ķīmisku līmēšanas poliklonālās (trušu) antivielām pret Mycobacterium tuberculosis. Krēpas paraugi pēc sārmainās izšķīdināšanas tiek neitralizēti ar skābu tris-HCl šķīdumu un inkubē ar imunomagnētisko sorbentu. Tad imūnferlo daļiņas savāc ar magnētisko stieni ar nomaināmu galu, pārnes uz mikrotube un nogulsnējas. Pievieno 20-30 μl 2% Triton X-100 šķīduma un sasilda 30 minūtes 90 ^° C ^{temperatūrā}. Uzsūknējs tiek izmantots kā DNS paraugs PCR analīzei.

Sarežģīta problēma ir mikobaktēriju tuberkulozes DNS izolēšana no biopsijas paraugiem. Enzīmu biopsijas gadījumā fermentu proteināzi K izmanto ar galīgo koncentrāciju 200-500 mg / l 56 ^° C temperatūrā nakti. Turklāt izmanto vienu no pazīstamām metodēm. Pārmērīga nespecifiskā DNS biopsiju PCR analīzē bieži izraisa reakcijas inhibēšanu, kas prasa atkārtoti ekstrahēt DNS.

Metodes rezultātu noteikšanai

Pēc reakcijas pabeigšanas patogēna amplitīvās DNS fragmentus identificē ar dažādām metodēm.

Gēla elektroforēzes metode ir labi pazīstama. Iegūtais DNS fragments tiek identificēts ar pozitīvu kontroli, kas satur vēlamo specifisko DNS fragmentu vai saskaņā ar zināmu izmēru (nukleotīdu poru skaitu) fragmentā, kuru nosaka, izmantojot standarta molekulāro marķieri.

Konkrēta krāsojuma klātbūtnē ēdijumbromīds ir iekļauts dubultšķiedrajā DNS. Sintezētais DNS fragments tiek noteikts kā joslā, kas gaismā darbojas ultravioletā starojuma iedarbībā.

DNS fragmenta izmērs, ko nosaka ar elektroforēzi no attāluma no sākuma, jāatbilst zināmam molekulmasas marķierim vai pozitīvai kontrolei.

Citas noteikšanas metodes PCR rezultātus, pamatojoties uz hibridizācijas vienu ķēdi PCR produktus ar oligonukleotīda papildina ar to - DNS zondi marķētas ar biotīns, kam seko atklāšanas via enzīmu reakcijās, piemēram, saistoties pie streptavidīns-biotīna sārmainās fosfatāzes.

Pamatojoties uz šāda veida noteikšanu, tika izveidoti PCR analizatori, kuros PCR rezultātu noteikšana tiek veikta automātiski, ņemot vērā optisko blīvumu paraugos pēc fermentatīvās reakcijas izpausmes.

Šo metožu trūkumi ir intralaboratīvā piesārņojuma iespējas ar diezgan īsiem DNS molekulu fragmentiem. Kad molekulas ievada jaunus paraugus, tās kļūst par PCR matricu un noved pie kļūdaini pozitīviem rezultātiem.

Šajā sakarā, lai novērstu kļūdaini pozitīvus rezultātus, tiek ieviesti stingri noteikumi par telpu nošķiršanu un izolēšanu: iegūt DNS no bioloģiskiem paraugiem; telpas, lai noteiktu rezultātus (elektroforēzi) no tīras zonas. Šīs telpas ir iespējamās piesārņošanas zona. Vēl viena izolēta teritorija ir tīra telpa, kurā ievada DNS paraugus, kas jāpārbauda caurulēs, ar PCR reakcijas maisījumu. Visbeidzot, tiek pieņemts, ka galvenā ierīce - DNS pastiprinātājs - jānovieto atsevišķā, iespējams, biroja telpā.

Lai novērstu produktu inficēšanu iepriekšējo reakciju - daži Likon-amp PCR sistēma tests vietā dezoksinukleozidtimidina satur dezoksinukleoziduridin kurš, kad in vitro sintēze circuit vietā iekļauts pareizā pozīcijā, t.i., Timoīna slāpekļa bāze, kas atrodas dabiskajā DNS, tiek aizstāta ar uracilu. Uracila DNA glycosylase tiek pievienots reakcijas maisījumam uz analīta, iznīcina tikai piesārņojošo fragmenti deoxyuridine, bet ne DNS native analizēti. Lt; / RTI & gt; Turpmākā apsildīšana 94 ^° C temperatūrā inaktivē šo fermentu un netraucē PCR amplifikācijai.

Pastāv testa sistēma, kas pamatojas uz rRNS izotermālo amplifikāciju, kurā vispirms tiek veikta DNS molekulu reversā transkripcija un sintēze. Kas, savukārt, ir matrica vēlākai RNS molekulu sintēzei. RNS amplikonus nosaka, izmantojot akridīna krāsotu DNS zondi, kad tie tiek hibridizēti reakcijas mēģenes šķīdumā. Šai metodei, papildus augstajai jutībai, ir priekšrocība analizēt vienā mēģenē, kas novērš piesārņojumu. Pēc autoru domām, šīs metodes jutīgums elpošanas paraugos sasniedz 90% ar specifiskumu 99-100%.

Jaunas noteikšanas metodes tiek ieviestas reālā laika PCR. Šīs metodes galvenokārt atšķiras šajā PCR un tā rezultātu noteikšana tiek veikta vienlaicīgi vienā slēgtā mēģenē. Tas ne tikai tehnoloģiski vienkāršo analīzes metodi, bet arī novērš laboratorijas telpu un paraugu piesārņošanu ar iepriekšējās PCR produktiem.

Reālā laika PCR noteikšanas rezultātus, ir saistīts ar fluorescences notiek ar fluorogenic hibridizācijas zondes DNS ar amplifitsi Rui-PCR konkrētā DNS fragmentu laikā laikā. Struktūra fluorogenic DNS zondes konstruēta tā, ka fluorescējošā marķieris tiek izdalīts kā rezultātā fermentatīvā reakcijā vai distancēti no dzēriens molekulu fluorescences tikai saskaņā ar īpašu hibridizāciju ar vēlamo DNS molekulas, kas pastiprina PCR laikā. Cik zondes molekulu hibridizē ar pieaugumu fluorescences ir proporcionāla konstatēto līmeni molekulu skaits amplificētu produktu. Tā kā pie katra cikla skaitu PCR fragments DNS molekulas, kuru reizina ar pusi, ciklu skaitu, pie kura fluorescence tiek noteikta un palielina apgriezti proporcionāls skaits DNS molekulu sākotnējā paraugā. Ja reakcija ir ieviest kā kalibratoru vairākas atšķirīgas zināmas koncentrācijas, molekulu, kas atbilst DNS fragmentu Mycobacterium tuberculosis, izmantojot datorprogrammu, var aprēķināt un apjomu genoma DNS analizējamajā materiālā.

Katrs standarta paraugs ir dublēts. Kvantitatīvais kritērijs ir minimālais PCR ciklu skaits, kas nepieciešams noteiktās fluorescences sākšanai un augšanai. Abscisā - ciklu skaits; ordinātam ir fluorescences vērtība. DNS koncentrācija ir apgriezti proporcionāla ciklu skaitam, kas vajadzīgs fluorescences parādīšanās. Labajā ailē (21-32) ir atzīmēti atbilstošo koncentrāciju cikliskie skaitļi. Atšķirības starp 10-kārtīgām DNS fragmentu koncentrācijām 10 ² -10 ⁶ ml - 3,2-3,4 cikli. Diviem pacientiem IS6110 fragmenti bija aptuveni 10 ³ / ml un 10 ⁴ / ml. Ņemot vērā Mycobacterium tuberculosis genomā analizēto fragmentu atkārtojumu skaitu (6-20), mikobaktēriju skaits klīniskajos paraugos ir attiecīgi aptuveni 100 un 1000 šūnas.

PCR izmantošana tuberkulozes diagnostikā

PCR metode visbiežāk tiek izmantota, lai paātrinātu tuberkulozes diagnostiku - mikobaktēriju tuberkulozes noteikšana klīniskajos paraugos: krēpas. Bronhu pietvīkums, pleiras eksudāts, urīns, cerebrospinālais šķidrums, osteolīzes punkts, sieviešu dzimumorgānu aspirāti un dažādi biopsijas paraugi. Šajā pētījumā Nīderlandē apmēram 500 krēpās un bronhu LAVAGE paraugi no 340 pacientiem ar apstiprinātu diagnozi plaušu tuberkuloze tika pētīta salīdzināt jutīgumu PCR metodēm, mikroskopija un kultūras studijas uztriepes. Analīzes jutīgums bija attiecīgi 92.6.88.9 un 52.4%. Visu metožu specifika bija aptuveni 99%.

Tika salīdzināta mikobaktēriju tuberkulozes noteikšanas efektivitāte, izmantojot mikroskopisko smidzinājumu, sējmašīna ar Levenstein-Jensen vidē, VASTES testa sistēma un PCR analīze. PCR bija jutība 74,4%, mikroskopija - 33,8%, sēšana uz blīvu vidē - 48,9% un VASTES - 55,8%. Vidējais sēklu noteikšanas laiks Levenstein-Jensen vidē ir 24 dienas. VASTES - 13 dienas, PCR - 1 diena.

Tiek apspriesta arī iespēja izmantot PCR kā jutīgu un ātru metodi tuberkulozes ārstēšanas efektivitātes kontrolei.

Atklāšana Mycobacterium tuberculosis DNS, izmantojot PĶR ar efektīvu ķīmijterapijas, noteikta ilgākā laika - vidēji 1,7 mēneši, salīdzinot ar uztriepes definēts fluorescējošā mikroskopu, un 2,5 mēnešus, salīdzinot ar bakterioloģisko pārbaudi.

Tuberkulozes ārpuslīnijas formu diagnostika

Vērtība kā jutīgu PCR metodi ir sevišķi liels, lai Ārpusplaušu formas, kā tas veido saskaņā ar šo klīnisko un rentgenogrāfiskajos metodes parasto bakterioloģiskām noteikšanas metodēm Mycobacterium tuberkulozes diagnostikas materiālu neefektīvu.

Izmeklējot urīna paraugu PCR rezultāti bija pozitīvi 16 no 17 pacientiem ar aktīvu tuberkulozi un negatīvo urīna 4 pacientiem neaktīvo nieru tuberkuloze un 39 pacientiem ar urīna sistēmas slimību nontubercular.

Pētījumos par kaulu smadzeņu aspirātiem pacientiem ar nezināmas izcelsmes drudzi tika pierādīta PCR analīzes efektivitāte gadījumos, kad ir aizdomas par tuberkulozi. Lai diagnosticētu tuberkulozo limfadenītu, bērniem tika pētīti 102 aspirātu izspiešanas punkti un 67 bērni, kuriem bija aizdomas par tuberkulozo limfadenītu, biopsijas paraugs. Pozitīvi rezultāti tika iegūti: 71,6% reālā laika PCR. Fluorescences mikroskopija - 46,3%. Kultūras pētījumi - 41,8%. Pētījumā ar 50 limfmezglu biopsijām pacientiem ar "kaķu scratch" slimību visi rezultāti bija negatīvi. Tādējādi tika pierādīta 100% PCR analīzes specifika. Tajā pašā darbā, ar limfmezglu punkcijas biopsiju, parādījās M. Avium noteikšanas iespēja.

Kā zināms, sieviešu dzimumorgānu neauglības tuberkulozes diagnostika ir viena no sarežģītākajām diagnozes problēmām. Kad pārbaudīja PCR biopsijas no endometrija endometrija aspirāti šķidri paraugi no Duglasa telpu 14 (56%) no 25 pacientiem pārbaudītie laparoscopically aizdomas tuberkulozi, tika iegūti pozitīvi rezultāti. Izmantojot smidzināšanas mikroskopiju un kultūru, iegūti attiecīgi 1 un 2 rezultāti. Šie gadījumi bija arī ar PCR pozitīvi. Lielākā daļa PCR pozitīvu rezultātu bija saistīti ar gadījumiem ar raksturīgām tuberkulozes pazīmēm saskaņā ar histoloģisko pētījumu; mazāks skaits - ar aizdomām par tuberkulozi pēc laparoskopijas datiem. Tika iegūts tikai viens pozitīvs PCR analīzes rezultāts, ja nav pieejami laparoskopiski dati par tuberkulozi.

Diagnozējot ārpuslīnijas tuberkulozes formas, klīnicistiem bieži ir jautājums par iespēju noteikt patogēnu, pārbaudot asins paraugus ar PCR metodi. Literaturālie dati liecina, ka no mikobaktērijas tuberkulozes iegūtā DNS atrašana no asins paraugiem ir iespējama ar tālejošām HIV infekcijas formām. Mycobacterium tuberculosis DNS tika atklāts tikai ar vispārēju dažādu orgānu tuberkulozi pacientiem ar transplantētu nieru un imūnsistēmas nomākumu.

[60], [61], [62], [63], [64], [65]

Mika baktēriju sugu identifikācija

PCR metode var būt diezgan efektīvs ātrai identificēšanai mikobaktēriju par tuberculosis kompleksa un daži mikobaktēriju nontubercular sugu saņemot savu sākotnējo izaugsmi. Šajā gadījumā PCR izmantošana var ietaupīt 7-10 dienas, kas vajadzīga, lai vēlāk kultūrā identificētu pozitīvu rezultātu. Pētniecība PĶR ir tehniski ļoti vienkārša, jo tas neprasa sarežģītu paraugu sagatavošanas klīnisko materiālu, lai sasniegtu augstu jutību. Šajā pētījumā 80 pozitīvo šajā testa sistēmu (MB Vasto. Organon uzņēmuma) visi pozitīvie kultūras PĶR bija stingri specifiska un tur 1 dienu. Lai noteiktu citu sugu mikobaktēriju sagatavošanā DNS patogēnu kultūras hibridizē īpašiem DNS zondēm marķētas ar akridīnu un atklāto izskatu hemiluminiscenci caur chemiluminometer vai nitrocelulozes sloksnīšu ar vizuālo novērtējumu pēc hibridizācijas celmu. Izmantojot šādu komplektu identificēt ierobežotu skaitu sugu: Mycobacterium tuberculosis kompleksu. M. Avium, M. Avium komplekss, M. Kansāzi un M. Gordonae.

A.Telenti et al. Arī izstrādāta relatīvi vienkāršu un lētu metodi sugu identifikācijā klīniski svarīgu sugu mikobaktēriju ar PĶR un tālākai apstrādei ar diviem restrikcijas enzīmu (fermenti, kam piemīt īpašības samazināt DNS molekulu pie konkrētiem punktiem). DNS fragments tiek amplificēts. Kas kodē karstuma šoka proteīna (65 kDa), un pēc tam apstrādāts iegūtajā PCR DNS fragmenta 439 nukleotīdu pāru atsevišķi divus fermentus - Bste II un Hae III. Pēc tam analizē, izmantojot agarozes gela elektroforēzi iegūst divus produktus, nosakot to lielumu (number of bāzu pāru), izmantojot standarta kopumu DNS fragmentiem (molekulārie DNS marķierus) garumā no 100 līdz 1000 bāzes pāriem. Katrā no īpašu veidu (M. Tuberculosis, M. Avium, M. Intracellulare, M. Kansasii, M.fortuitum) atklāt divas vai trīs DNS fragmentus ar dažādiem izmēriem, lai katram ierobežojuma fermentu. Dažādu iegūto DNS izmēru kombinācija ļauj šīs sugas atšķirt savā starpā.

Tiek izstrādāta bioloģiskās DNS mikroķirurģijas tehnoloģija. Kas palīdzēs identificēt vairāk nekā 100 mikobaktēriju sugas vienā pētījumā.

Sugas identifikāciju var veikt arī ar 16S rRNS mainīgā apgabala PCR amplifikāciju, kam seko amplikona secība, salīdzinot ar atbilstošo primāro struktūru, kas ļauj identificēt vairāk nekā 40 mikobaktēriju sugas.

Ar PCR palīdzību var veikt arī sugas identifikāciju Mycobacterium tuberculosis kompleksā, ieskaitot M. Bovis un M. Bovis BCG diferenciāciju. Lai to paveiktu, tiek analizēta dažu gēnu klātbūtne vai trūkums RD1 genoma reģionos. RD9 un RD10. RD1 nav sastopams M. Bovis BCG, bet ir sastopams vīrusu izraisītās sugās, ieskaitot M. Bovis.

Mycobacterium tuberculosis zāļu jutīguma noteikšana ar PCR

Mērķi molekulāro ģenētisko metožu narkotiku jutību vai pretestības Mycobacterium tuberculosis samazināt, lai identificētu mutācijas īpašos nukleotīdu sekvenču zināmajiem gēnu. Pamatmetodes pamatā ir vai nu uz tiešu prochityvanii (secības) šo sekvences pēc pastiprināšanas vai hibridizācijas biotīna iezīmēta DNS fragmentu papildināts ar polimerāzes ķēdes reakciju DNS zondēm laikā. Abas alternatīvas ietver tādu nukleotīdu aizvietotas sekvencēm, ka, izmantojot DNS zondes noved pie trūkuma vai nepilnīgu hibridizācija uz nitrocelulozes membrānu, izmantojot fermenta konjugātu (streptavidīns-sārmainās fosfatāzes) - metode Lipa-Rif-TB.

Mērīšanas metode fluorescenci lokāli fiksēts uz microsections DNS zondes papildina ar zināmām mutācijas, PCR amplificēto gēnu reģioniem, kas atbildīgas par rezistenci vai narkotiku jutīgumu, ko sauc par mikrobiochipov metode. Galvenais algoritms šī pētījuma veikšanai ir šāds. Pēc tam, kad izolē DNS no klīniskā parauga vai kultūras mikobaktēriju ir nepieciešams, lai veiktu PCR amplifikāciju attiecīgo fragmentu rpoB gēns, kas atbild par narkotiku jutību pret rifampicīnu vai katG un inhA gēnu, kas kodē olbaltumvielas Mycobacterium ir atbildīgs par jutību pret izoniazīdu. PCR rezultāti tika novērtēts ar agarozes gela elektroforēzi, kurā apstiprināt saņemšanu atbilstošus DNS fragmentu vajadzīgajā garumā. Tad tiek veikta otrā PCR kārta, lai ieviestu fluorescējošo etiķeti DNS. PCR rezultāti atkal tiek apstiprināti ar gēla elektroforēzi. Pēc tam, hibridizācija tika veikta (nakti inkubācija), kam seko mazgājot iegūto materiālu par biochip, kas ir liels skaits fiksēto mazā stikla plākšņu īsos DNS šķiedrās (zonde), kas papildina nukleotīdu sekvences narkotiku-jūtīgs tipa Mycobacterium tuberculosis vietās iespējamo mutāciju. Kā arī mutāciju sekvences, kas atbildīgas par zāļu rezistenci. Atrašanās vieta DNS zondes uz plāksnes - strikti noteikts, un līmenis fluorescences novērota pēc hibridizācija, lai noteiktu rezultātu, izmantojot īpašu lasīšanas ierīci ir uzstādīta. Šajā sakarā analīzes rezultātus nosaka ar speciālu datorprogrammu.

Pēdējos gados ir izstrādātas alternatīvas metodes, lai noteiktu mikobaktēriju tuberkulozes atkarību no narkotikām, pamatojoties uz reālā laika PCR tehnoloģiju, kas ļauj veikt šos pētījumus slēgtā mēģena testā.

Attēlā 13-13 parāda mikobaktēriju tuberkulozes klīnisko kultūru analīzes rezultātus, nosakot zāļu rezistenci pret rifampicīnu, izmantojot reālā laika PCR: 218 - kontroles paraugs (jutīgs pret rifampicīnu); 93 - Ser-Trp TCG-TGG pozitīvā kontrole; 4482 - Ser-Leu TCG-TTG pozitīva kontrole; 162-322 - eksperimentālie paraugi. Paaugstināšanas kinētisko līkņu aprēķina rezultāts 4 kanāliem: kanāls 1: 393 - Ser-Trp TCG-TGG pozitīvā kontrole; kanāls 2: 4482 - Ser-Leu TCG-TTG pozitīvā kontrole; 162, 163, 172, 295 - eksperimentālie paraugi; 4. Kanāls: eksperimentā iesaistīto visu paraugu amplifikācijas kinētiskās līknes. Pozitīva amplifikācijas reakcijas kontrole. Secinājumi: Pamatojoties uz analīzes rezultātiem, tika identificētas šādas mutācijas, kas nosaka izturību pret rifampicīnu: paraugos 162,163,172,295-Ser-Leu TCG-TTG. To pašu principu lietoja, lai noteiktu zāļu rezistenci pret izoniazīdu gēnu katG un inhA, kas nosaka biežākās mutācijas.

[66], [67], [68], [69], [70], [71],

Mikobaktēriju tuberkulozes celma identifikācija

Vairumā rūpīgi pētīta metode no identifikācijas celmu Mycobacterium tuberculosis ir paņēmiens, ko sauc par restrikcijas fragmentu garuma polimorfisma (RFLP RFLP,. Vai angļu variantā) un kas ir balstīta uz fragmentirovanin (ierobežojuma) no Mycobacterium tuberculosis DNS fermentu Pvu II un fragmenti, ko iegūst turpmāku hibridizāciju ar dažiem konkrētiem sekvencēm DNS tās atkārtotais elements IS6110. Intrapecifiskā mainība tiek realizēta, ņemot vērā atšķirīgo skaitu IS6110 atkārtojumu un to atrašanās vietu DNS. Kā arī dažādu attālumu starp noteiktiem enzīmu ierobežojošo enzīmu uzbrukuma punktiem (restrikcijas vietnēm) un IS6110 elementu. Šī tehnoloģija ir ļoti sarežģīta un laikietilpīga. Pēc ārstēšanas ar DNS, kas iegūta no kultūras Mycobacterium tuberculosis, gēla elektroforēzi tiek veikta ar restrikcijas enzīmu, un pēc tam pārvieto DNS fragmentus dažāda garuma uz nitrocelulozes membrānu, hibridizācija tika veikts ar fragmentiem IS6110-elementu un noteikt ar enzīmu reakcijās. Iegūtais specifiskais joslu modelis raksturo konkrēta Mycobacterium tuberculosis celma DNS. Ar datora analīzes palīdzību atklāj celmu identitāti vai saistību. Neraugoties uz to, ka RFLP metode ir visvairāk diskriminējošā, t.i. Identificē visvairāk atšķirības celmu analizēto, tā ir neefektīva nelielu skaitu (mazāk nekā 5) IS6110-atkārtojas novērota dažos celmu. Attēlā 13-14 parāda RFLP tipa celmu rakstīšanas rezultātus.

Alternatīva var būt spoligotīpēšanas metode - plazmas DNS sekvenču polimorfisms - starpība starp DR reģiona tiešajiem atkārtojumiem. Veicot spoligotipizāciju ar celmiem, PCR tiek veikta ar praimeriem, kas ierobežo DR reģionu, pēc tam tiek veidoti dažāda garuma fragmenti, kas hibridizējas ar DNS mainīgajiem starpposma reģioniem. Tiek sniegta DR reģiona starpliku secību analīze. Pēc pētnieku domām, ir vienkāršāki, produktīvāki un piemēroti celmu primārajai skrīningam un provizoriskai epidemioloģiskai analīzei, kā arī tieši pētniecībai klīniskajā materiālā.

Acīmredzot efektīvāka un tehnoloģiski pieejamākā metode ir VNTR (angļu vārdu saīsinājums) vai arī metode, kā noteikt precīzu tandēmu atkārtojumu mainīgo skaitu Mycobacterium tuberculosis DNS. Šī metode ir balstīta tikai uz PCR izmantošanu un neprasa papildu manipulācijas. Tā kā tandēmu atkārtojumu skaits dažādos celmos un dažādās lokās ir atšķirīgs, dažādu izmēru fragmentus nosaka un analizē, iegūstot PCR produktu elektrofororegrāfiju. Pēc pētnieku domām, izmantojot VNTR, tiek panākta lielāka celmu diskriminācijas pakāpe nekā RFLP metodei.

Pēdējos gados liela uzmanība ir pievērsta W-Pekinas ģimenes Mycobacterium tuberculosis celmiem (dažkārt to sauc par Pekinas celmu), kas lielā mērā ir izturīgi pret zāles.

Pamatprasības molekulāro bioloģisko pētījumu kvalitātei

[72], [73], [74], [75],

Pamata reglamentējošie dokumenti PCR

Pasūtījumi Krievijas Veselības ministrija: №45 no 02.07.2000 g .. Numurs 109 no 21.03.2003 g .. Numurs 64 no 21.02.2000, pamatnostādņu: 1.3.1888-04 "organizācija darba pētījumos, izmantojot PĶR materiālu inficēti ar patogēno bioloģiskā patogēno vielu III-IV grupas aģenti "; 1.3.1794-03 "Darba organizācija, pētot PCR materiālu, inficētu ar I-II patogenitātes grupu mikroorganismiem". 2003; 3.5.5.1034-01 "Dezinficēšana materiāla, inficēti baktērijas I-IV patogenitātes grupas, ja izmanto PĶR", 2001 papildinājumā 11. Vienotiem instrukcijas mikrobioloģisko eksaminācijas metodes identifikācijas, diagnostikā un ārstēšanā tuberkulozes.

[76], [77], [78]

Personāls

Izpilde molekulāro bioloģisko izpēti var turēt ārstiem klīniskās laboratorijas diagnostika, ārstiem bacteriologists, virusologiem, ārsti, biologi, klīniskās diagnostikas laboratoriju, kā arī speciālisti ar vidējo medicīnisko izglītību, pagājis specializāciju un modernu apmācību noteiktajā veidā.

Laboratorijas telpu iekārtošana

Ir nepieciešamas sekojošas laboratorijas telpas:

• Paraugu apstrādes zona ir laboratorija, kas piemērota darbam ar III-IV patogenitātes grupu infekcijas izraisītājiem, saskaņā ar Metodisko norādījumu 13.1888-04.
• Zona reakcijas maisījumu sagatavošanai PCR - laboratorijas telpa, kas nodrošina aizsardzību no iekšējā laboratorijas piesārņojuma - "tīra" zona.
• • Ja PCR produktus analizē, izmanto elektroforēzi vai hibridizāciju. Laboratorijas telpa, kurā reizināts DNS fragmenti tiek iegūtas no caurules un pastiprināšanas, attiecīgi, var nokļūt vidē, saskaņā ar prasībām PCR laboratorijas (1.3.1794-03 pamatnostādnes, Virzības 1.3.1888-04) jābūt pilnībā ir izolēts no iepriekšējos punktos norādītajām telpām. Būtu jāizslēdz no kustības zonas uz zonu elektroforēzes par paraugu apstrādi un "tīru" platība jebkādu personālu, aprīkojumu, jebkādiem materiāliem un priekšmetiem, kā arī nodošanu gaiss caur ventilācijas sistēmu, vai kā rezultātā projektu. Šī zona nav nepieciešama PCR produktu fluorimetriskai noteikšanai.
• Dokumentu un rezultātu apstrādes telpa ir aprīkota ar datoriem un nepieciešamo biroja aprīkojumu. Šajā numurā var būt iekārtojums, kas nodrošina PCR produktu atklāšanu, neatverot mēģeni. - fluorescējošie PCR detektori un termoakumulatori reālā laika PCR.

Sanitārās un epidemioloģiskās prasības attiecībā uz primāro ārstēšanu ar krēpu ir līdzīgas standarta mikrobioloģiskajām prasībām, kas nepieciešamas darbam ar mikobaktēriju tuberkulozi.

[79], [80], [81], [82],

Laboratorijas iekārtu pabeigšana PCR diagnostikai

Laboratorijā ietilpst aprīkojums šādām telpām.

• paraugu sagatavošanas telpa satur šādu aprīkojumu: aizsardzības klases "SP-1.2" II lamināram: cietvielu termostats ar apsildes vāku "Eppendorf" tipa mēģenēm; mikrocentrifuga pie 13 000 apgriezieniem minūtē; centrifūga (Vortex); ledusskapis ar temperatūras intervālā no -20 ^līdz C 10 līdz ^aptuveni C; "Rroline" sērijas maināmā tilpuma pipetes; sūknis ar OM-1 slazdošanas kolbu; statīvs pipetēm; statīvs darbstacijas 200x0,5 ml; statīvs darbstacijai 50x1,5 ml; Statīvi tvertņu uzglabāšanai 80x1,5 ml;
• Reakcijas maisījuma sagatavošanas telpa: aizsardzības kameras PCR kaste ("Laminar-C. 110 cm); centrifūga - Vortex; Proline sērijas mainīgas tilpuma pipetes; statīvs pipetēm; statīvs darbstacijas 200x0,2 ml; Statīvi tvertņu uzglabāšanai 80x1,5 ml; ledusskapis ar temperatūras intervālā no -20 ^līdz C līdz + 10 ^of C;
• telpa elektroforēzei: kamera horizontālā elektroforēzei; elektroapgāde; transilluminātājs;
• DNS pastiprinātāji vai nukleīnskābju analizators (PCR reālā laikā) ar datoru un programmatūru; var ievietot jebkurā brīvā telpā. Ja tiek izmantota reālā laika PCR tehnoloģija. Telpa elektroforēzei nav nepieciešama.

[83], [84], [85], [86]

Ārējā kvalitātes kontrole

Lai pārliecinātos par objektīvi ticamu rezultātu iegūšanu, laboratorijām būtu jāpiedalās laboratorijas pētījumu kvalitātes ārējā novērtēšanā.

Kvalitātes kontroles sistēmas dalībnieki saņem; 12 flakoni ar liofilizētā baktēriju šūnu suspensiju, no kuriem divi satur E. Coli E. Kokosšķiedrām 3 flakoni ar Mycobacterium tuberculosis (avirulentais celms) 10 ² / ml; 3 ampulas ar līdzīgu celmu šūnām koncentrācijā ^10,4 / ml; 2 ampulas ar ne-tuberkulozes mikobaktērijām M. Avium-intracellulare un M. Kansasii koncentrācijā 10 ⁵ / ml.

Izplatītie ārējās kvalitātes novērtēšanas testi ir iepriekš pārbaudīti divās neatkarīgās laboratorijās, kurām ir plaša pieredze šajā jomā.

[87], [88]