Osteoartrīta eksperimentālie modeļi

Skrimšļi ir augsti specializēti audi, kas satur tikai viena veida šūnas (hondrocītus) un kam raksturīgs asins un limfvadu trūkums. Skrimšļus galvenokārt baro absorbcija no sinoviālā šķidruma. Hondrocītu metabolismu regulē vairāki šķīstoši faktori, ko lokāli ražo hondrocīti un apkārtējie audi. Hondrocītu funkcija ir atkarīga arī no ekstracelulārās vides sastāva (skābekļa sprieguma, jonu koncentrācijas, pH utt.), ārējās membrānas (ECM) sastāva, šūnu un matricas mijiedarbības un fizikāliem signāliem. Eksperimentālās modelēšanas galvenais mērķis ir radīt kultūras ekstracelulārajā vidē, nemainot nobriedušu šūnu fenotipu. Otrais mērķis ir radīt kultūras, lai pētītu hondrocītu priekšlaicīgu, aizkavētu, īslaicīgu vai ilgstošu reakciju uz ķīmiskiem un/vai fizikāliem signāliem. In vitro pētījumi sniedz arī iespēju pētīt hondrocītu uzvedību osteoartrīta gadījumā. Trešais mērķis ir izstrādāt kopkultūru sistēmas, kas ļauj pētīt dažādu audu mijiedarbību locītavā. Ceturtais uzdevums ir skrimšļa implantu sagatavošana turpmākai transplantācijai. Visbeidzot, piektais uzdevums ir augšanas faktoru, citokīnu vai terapeitisko līdzekļu izpēte, kas spēj stimulēt reparāciju un/vai kavēt skrimšļa rezorbciju.

Pēdējo desmitgažu laikā ir izveidoti dažādi locītavu skrimšļu šūnu kultūru modeļi, tostarp monoslāņa kultūras, suspendētās kultūras, hondronu kultūras, eksplantāti, kokultūras un nemirstīgas šūnu kultūras. Katrai kultūrai ir savas priekšrocības un trūkumi, un katra no tām ir piemērota viena konkrēta hondrocītu metabolisma aspekta izpētei. Tādējādi skrimšļu eksplantāti ir lielisks modelis matricas elementu aprites izpētei, kam nepieciešami īsti šūnu virsmas receptori un normāla šūnu-matricas un matricas-šūnas mijiedarbība. Vienlaikus ieteicams pētīt matricas nogulsnes vai mehānismus, kas regulē hondrocītu metabolismu, uz izolētu šūnu kultūras. Zema blīvuma monoslāņa kultūra ir nepieciešama, lai pētītu šūnu diferenciācijas procesu. Dabīgā vai sintētiskā matricā suspendētas kultūras ir modelis hondrocītu adaptīvās reakcijas uz mehānisko stresu analīzei.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ], [ 5 ], [ 6 ], [ 7 ]

Hondrocītu kultūras

Izvēloties skrimšļa audus in vitro pētījumiem, jāņem vērā vairāki svarīgi punkti. Hondrocītu matricas sastāvs un vielmaiņas aktivitāte dažādās locītavās atšķiras, un pēdējais ir atkarīgs arī no hondrocītu atrašanās vietas dziļuma audos. Šie dati tika iegūti vairākos eksperimentos, kuros tika pētītas izolētas hondrocītu apakšpopulācijas no dažāda dziļuma skrimšļa zonām. Tika konstatētas vairākas morfoloģiskas un bioķīmiskas atšķirības starp kultivētiem hondrocītiem, kas atrodas locītavu skrimšļa virspusējos un dziļajos slāņos. Virspusējās šūnas sintezē retu, proteoglikāniem nabadzīgu fibrillāru matricu, savukārt dziļākās šūnas ražo matricu, kas bagāta ar fibrillām un proteoglikāniem. Turklāt virspusējās šūnas ražo relatīvi vairāk mazu, neagregētu proteoglikānu un hialuronskābes un relatīvi mazāk aggrekāna un keratāna sulfāta nekā dziļāki hondrocīti. Vēl viena svarīga hondrocītu, kas izolēti no dažāda dziļuma skrimšļa zonām, metabolisma īpatnība ir reakcija uz eksogēnu stimulu. Saskaņā ar M. Aydelotte et al. datiem, liellopu hondrocīti no skrimšļa virspusējās zonas bija jutīgāki pret IL-1 nekā šūnas no dziļās zonas.

Šūnu uzvedība ir atkarīga arī no audu atrašanās vietas. Hondrocīti no viena un tā paša dzīvnieka ribu un auss skrimšļa atšķirīgi reaģē uz augšanas faktoriem, piemēram, fibroblastu augšanas faktoru (FGF) un TGF-beta. FGF palielināja timidīna, prolīna un leicīna iekļaušanu kultivētās ribās, bet ne auss hondrocītos. TGF-beta palielināja timidīna iekļaušanu ribu un auss skrimšļa hondrocītos, bet neietekmēja timidīna un prolīna iekļaušanu auss hondrocītos. Skrimšļa šūnas no augsta stresa zonām atšķiras no tām, kas iegūtas no zema stresa zonām uz skrimšļiem. Tādējādi nobriedušu aitu ceļa locītavas skrimšļa hondrocīti no stilba kaula locītavas virsmas centrālā apgabala, ko neklāj menisks, kam in vivo ir vislielākā slodze, sintezē mazāk agrekāna, bet vairāk dekorīna nekā šūnas no meniska pārklātajām zonām. Autori arī uzsver, cik svarīgi ir izmantot skrimšļus no identiskām locītavu zonām, pētot locītavu sintētisko funkciju.

Hondrocītu metabolisms un to reakcija uz regulējošiem faktoriem ir būtiski atkarīga arī no donora vecuma, skeleta attīstības un locītavu stāvokļa, no kurām šūnas tiek ņemtas. Cilvēka hondrocītos novēro ievērojamu proliferatīvās atbildes reakcijas samazināšanos līdz ar vecumu. Vislielākais samazinājums novērojams donoriem vecumā no 40 līdz 50 gadiem un vecākiem par 60 gadiem. Turklāt proliferatīvās atbildes reakcijas smagums uz augšanas faktoriem (piemēram, FGF un TGF-beta) samazinās līdz ar novecošanu. Papildus kvantitatīvām izmaiņām hondrocītu proliferācijā pastāv arī kvalitatīvas izmaiņas. Jaunu donoru (10–20 gadi) šūnas labāk reaģē uz trombocītu augšanas faktoru (PDGF) nekā uz TGF-beta, savukārt pieaugušu donoru šūnās novēro pretējo. Lai izskaidrotu ar vecumu saistītās izmaiņas hondrocītu sintētiskajā funkcijā un to reakcijā uz augšanas faktoriem, tiek izmantoti vairāki mehānismi. Tie ietver virsmas šūnu receptoru skaita un afinitātes samazināšanos, augšanas faktoru un citokīnu sintēzes un bioaktivitātes izmaiņas, kā arī postreceptoru signālu modifikāciju.

Locītavu patoloģiskais stāvoklis maina arī hondrocītu morfoloģiju un vielmaiņas aktivitāti. Tādējādi J. Kouri et al. (1996) identificēja trīs hondrocītu apakšpopulācijas skrimšļos osteoartrīta gadījumā. Hondrocīti no skrimšļa virspusējās un augšējās vidusdaļas veido klasterus un sintezē lielāku proteoglikānu un kolagēna daudzumu. TGF-beta un insulīnam līdzīgais augšanas faktors (IGF) spēj stimulēt proteoglikānu sintēzi hondrocītos un daļēji neitralizēt IL-1 un TNF-a iedarbību. Osteoartrīta skarto skrimšļu eksplantāti un no osteoartrīta pacienta skrimšļa izolēti hondrocīti ir jutīgāki pret TGF-beta stimulāciju nekā veselu skrimšļu hondrocīti. Šīs atšķirības, visticamāk, ir saistītas ar fenotipiskām izmaiņām hondrocītos locītavu skrimšļa augšējos slāņos.

Atsevišķu hondrocītu izolēšana tiek panākta, secīgi apstrādājot ECM ar proteolītiskiem enzīmiem. Pēc to atbrīvošanas no ECM izolētās šūnas ir ideāli piemērotas matricas komponentu de novo sintēzes izpētei. Daži autori izmanto tikai klostridiālo kolagenāzi, bet citi iepriekš inkubē skrimšļus ar tripsīnu, pronāzi, DNāzi un/vai hialuronidāzi. Izolēto šūnu skaits ir atkarīgs no izmantotajiem enzīmiem. Tādējādi, apstrādājot tikai ar kolagenāzi, no 1 g audu var iegūt ^{1,4–106 hondrocītus, savukārt, izmantojot pronāzi, hialuronidāzi un kolagenāzi –4,3–106}. Apstrādājot ar kolagenāzi, aggrekāns, olbaltumvielas, IL-6 un IL-8 šūnu kultūrā saglabājas ievērojami lielākā daudzumā nekā secīgi apstrādājot ar dažādiem enzīmiem. Šīm atšķirībām starp abām šūnu kultūrām ir vairāki skaidrojumi:

• Šūnu receptorus bojā vai kavē enzīmi, TGF-beta kavē DNS un proteoglikānu sintēzi svaigi izolētos hondrocītos (1. dienā), savukārt DNS un proteoglikānu sintēzi monoslānī kultivētos hondrocītos (7 dienas) stimulē TGF-beta. Tomēr pirms eksperimenta sākuma ir nepieciešams atbilstošs periods šo membrānas komponentu atkārtotai ekspresijai.
• Eksogēnās proteāzes var pārtraukt integrīna mediēto šūnas un matricas mijiedarbību. Integrīnu saime veicina hondrocītu piesaistīšanos ECM molekulām (Shakibaei M. et al., 1997). Šie traucējumi var ietekmēt matricas gēnu ekspresiju.
• Matricas komponentu atliekas var regulēt hondrocītu sintētisko funkciju. Integrīni spēj atpazīt ECM degradācijas produktus, tādējādi spēlējot svarīgu lomu audu atjaunošanā pēc proteolītisko enzīmu darbības. T. Larsons et al. (1989) ziņoja, ka neskartu vai fragmentētu proteoglikānu pievienošana šūnu kultūrai stimulē olbaltumvielu un proteoglikānu sintēzi. Tomēr augsts hialuronskābes līmenis izraisa ievērojamu sulfātu iekļaušanas samazināšanos proteoglikānu sintēzē vistas embrija hondrocītos, nobriedušos cūkas hondrocītos un žurkas hondrosarkomas šūnās. Turklāt hialuronskābe ir proteoglikānu izdalīšanās no šūnām inhibitors pat IL-1b, TNF-α, FGF klātbūtnē, kas norāda uz augšanas faktoru un citokīnu pirmās bioloģiskās aktivitātes neitralizēšanu. Precīzs hialuronskābes darbības mehānisms joprojām nav skaidrs; ir zināms, ka hondrocīti satur hialuronskābes receptoru, kas saistīts ar citozola aktīna pavedieniem. Hialuronskābes saistīšanās ar tās receptoru stimulē olbaltumvielu fosforilēšanu. Tādējādi šie dati parāda hondrocītu vielmaiņas funkcijas modulāciju ar fragmentētām vai dabiskām matricas olbaltumvielu molekulām, aktivizējot šūnu membrānas receptorus.
• Hondrocītu matricas olbaltumvielu sintēzes strauja stimulēšana ar enzīmu palīdzību var būt hondrocītu formas izmaiņu un/vai citoskeleta reorganizācijas sekas.
• Daži citokīni (piemēram, IL-8) un augšanas faktori (piemēram, IGF-1, TGF-β) tiek piesaistīti ārējās šūnas matricā (ECM). Vispazīstamākais piemērs ir TGF-β saistīšanās ar dekorīnu, kā rezultātā samazinās pirmā spēja inducēt šūnu augšanu Ķīnas kāmja olnīcu šūnās. Atklājums, ka dekorīna saturs skrimšļos palielinās līdz ar vecumu, liecina par TGF-β biopieejamības samazināšanos līdz ar novecošanu. Augšanas faktori un citokīni var tikt atbrīvoti no matrices atliekām kultūras laikā un pēc tam modulēt hondrocītu funkciju.

[ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

Hondrocītu vienslāņu kultūra

Hondrocītu diferencēto fenotipu galvenokārt raksturo II tipa kolagēna un audu specifisko proteoglikānu sintēze, kā arī zems mitotiskās aktivitātes līmenis. Ir pierādījumi, ka ilgstoši kultivējot šūnas monoslānī, kā arī pēc vairākām atkārtotām šūnu pārejām, hondrocīti zaudē savas sfēriskās kontūras un iegūst iegarenu, fibroblastiem līdzīgu formu. Ar šādu fibroblastisku metaplāziju mainās arī šūnu sintētiskā funkcija, ko raksturo pakāpeniska II, IX un XI tipa kolagēnu sintēzes samazināšanās un I, III un Y tipa kolagēnu sintēzes palielināšanās. Funkcionālā aggrekāna dēļ tiek sintezēti mazi neagregēti proteoglikāni. Katepsīna B un L sintēze diferencētās šūnās ir ārkārtīgi zema, bet palielinās diferenciācijas zuduma procesā. Diferencētos hondrocītos tiek ekspresēta kolagenāze-1; ilgstoši kultivējot, tās ekspresija samazinās, bet palielinās metaloproteināžu (TIMP) audu inhibitoru ražošana.

Diferencēti hondrocīti atkārtoti ekspresē diferencētā fenotipa kolagēnu, kad tie tiek pārnesti no monoslāņa uz suspendētu kultūru. Diferenciācijas process, iespējams, ir saistīts ar šūnas formu. Šo īpašību regulāri izmanto pētnieki, kas pēta defektīvus transplantātus ar autologiem hondrocītiem. Nelielu skaitu šūnu, kas iegūtas no biopsijas materiāla, var palielināt monoslāņa kultūrā un pēc tam pirms transplantācijas atkārtoti ievietot trīsdimensiju matricā. Specifiska fenotipa atkārtotu ekspresiju dediferencētos hondrocītos, kas pārnesti uz agarozes kultūru, var stimulēt ar TGF-β, oseīna-hidroksiapatīta kompleksu un askorbīnskābi.

Reaģējot uz augšanas faktoriem un citokīniem, diferenciācijas procesā hondrocīti tiek modificēti. Šūnu reakcija uz citokīniem un augšanas faktoriem atšķiras starp nediferencētiem un diferencētiem hondrocītiem. IL-1 stimulē fibroblastu proliferāciju, turpretī nediferencētu hondrocītu augšanu IL-1 kavē. DNS sintēzi stimulē IGF-1 pagarinātos, bet ne saplacinātos hondrocītos. Diferencētos hondrocītos IL-1beta un TNF-α stimulējošā ietekme uz prokolagenāzes ražošanu ir izteiktāka nekā nediferencētos hondrocītos.

Hondrocītu kultivēšana

Hondrocītu kultivēšana suspensijā šķidrā vidē vai dabiskā vai sintētiskā trīsdimensiju matricā stabilizē hondrocītu fenotipu. Šūnas saglabā savu sfērisko formu un sintezē audiem specifiskus proteīnus. Hondrocītu suspendētā kultūra parasti tiek ieteikta jaunas pericelulārās matricas veidošanās izpētei. Hondrocītu kultūras sintētiskos vai dabiskos absorbējošos polimēros tiek izmantotas šūnu implantēšanai skrimšļa defektos, lai stimulētu locītavu skrimšļa audu reģenerāciju. Sintētiskajai vai dabiskajai videi implantētajām šūnām jāatbilst vairākām prasībām:

• implantiem jābūt ar porainu struktūru šūnu adhēzijai un augšanai,
• ne pats polimērs, ne tā noārdīšanās produkti, implantējot in vivo, nedrīkst izraisīt iekaisumu vai toksiskas reakcijas,
• transplantāta nesējam jāspēj saistīties ar blakus esošo skrimšļu vai subhondrālo kaulu,
• dabīgajai vai sintētiskajai matricai jāspēj absorbēt, tās degradācijai jābūt līdzsvarotai ar audu reģenerāciju,
• Lai veicinātu skrimšļa atjaunošanos, matricas ķīmiskajai struktūrai un poru arhitektūrai jāveicina šūnu fenotipa uzturēšana un audiem specifisku olbaltumvielu sintēze ar tajā ievietoto hondrocītu palīdzību,
• In vivo implantācijas laikā ir nepieciešams pētīt sintētiskās vai dabiskās matricas mehāniskās īpašības.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ], [ 16 ]

Hondrocītu suspensija šķidrā fāzē

Šūnu piestiprināšanos plastmasas traukiem, kuros kultivē hondrocītus, var novērst, pārklājot to sienas ar metilcelulozes, agarozes, hidrogela (poli-2-hidroksietilmetakrilāta) vai kolagēna-agarozes maisījuma šķīdumu. Šādos apstākļos hondrocīti veido klasterus un sintezē galvenokārt aggrekānu un audu specifiskos kolagēnus (II, IX, XI tipi). Parasti ir sastopami divu veidu šūnas. Šūnas, kas atrodas centrā, saglabā sfērisku formu un tās ieskauj labi attīstīts ārējās šūnas slānis (ECM), ko apstiprina histoķīmiskie un ultrastrukturālie pētījumi. Perifērijā hondrocītiem ir diskveida kontūras un tos ieskauj reta ECM; par šādu šūnu funkcionālajām īpašībām ir maz zināms.

Hondrocītus ir iespējams kultivēt uz mikronesējiem, kas uzturēti suspensijā; kā mikronesēji tiek izmantotas dekstrāna lodītes (cytodex), ar kolagēnu pārklātas dekstrāna lodītes (cytodex III) un neporainas I tipa kolagēna mikrosfēras (celagēns). Šādos kultivēšanas apstākļos hondrocīti piestiprinās pie mikronesēja virsmas, saglabā savu sfērisko formu un veido matricai līdzīgu materiālu. Turklāt celagēna izmantošana veicina hondrocītu proliferāciju un normālā fenotipa atkārtotu ekspresiju. Tādēļ hondrocītu kultivēšanu uz celagēna mikrosfērām var izmantot, lai atjaunotu šūnu fenotipu pirms transplantācijas.

Vēl viena hondrocītu suspensijas kultivēšanas metode šķidrā vidē ir to kultivēšana blīvu šūnu bumbiņu veidā (0,5-1 * 10 ^b ), kas iegūtas ar centrifugēšanu. Šādi hondrocīti spēj radīt matricu, kas satur lielu daudzumu proteoglikānu, II tipa kolagēna, bet ne I tipa kolagēna, ko apstiprina histoloģiskās, imūnhistoķīmiskās un kvantitatīvās metodes.

Hondrocītu suspensija dabiskajā ECM

Hondrocītus var kultivēt suspensijā trīsdimensiju matricā (mīkstā agarā, agarozē, kolagēna želejā vai sūklī, hialuronskābē, fibrīna līmē, algināta lodītēs).

Agarozē kultivēti hondrocīti saglabā savu normālo fenotipu un sintezē II tipa kolagēnu un audiem specifiskus agrekāna agregātus. Kultivējot agarozē, šūnas sintezētie proteoglikāni 50 dienas tiek atbrīvoti vidē. Salīdzinājumam, monoslāņa kultūrā šūnu fāze jau pirmajās 5-6 kultivēšanas dienās ir pārpildīta ar glikozaminoglikāniem; kultivējot vidē pēc palielinātas glikozaminoglikānu sintēzes un atbrīvošanās pirmajās 8-10 dienās notiek to laika gaitā atkarīga samazināšanās. Tomēr hondrocītu uzvedība, kultivējot agarozē, atšķiras no uzvedības in vivo. Agarozē liels skaits sintezētu agrekāna agregātu satur mazākas molekulas un mazāk molekulu nekā in vivo. TGF-β stimulē proteoglikānu sintēzi eksplantā, bet samazina agrekāna sintēzi agarozē.

^{Algināts ir lineārs polisaharīds, kas iegūts no brūnajām jūraszālēm. Divvērtīgu katjonu, piemēram, Ca2 +} jonu, klātbūtnē šis polimērs pārvēršas želejā. Katru alginātā iesprostoto hondrocītu ieskauj negatīvi lādētu polisaharīdu matrica, kuras poras ir salīdzināmas ar hialīna skrimšļa porām. Matrica, ko algināta lodītēs veido hondrocīti, sastāv no diviem nodalījumiem - plāna ar šūnām saistītas matricas slāņa, kas atbilst locītavu skrimšļa pericelulārajai un teritoriālajai matricai, un attālākas matricas, kas atbilst starpteritoriālajai matricai dabiskos audos. Kultivēšanas 30. dienā šūnu un katra no diviem nodalījumiem algināta lodītē aizņemtais relatīvais un absolūtais tilpums ir gandrīz pilnībā identisks dabiskajam skrimšlim. Gandrīz 30 dienas hondrocīti saglabā savu sfērisko formu un ražo aggrekānu, kura hidrodinamiskās īpašības ir līdzīgas aggrekāna molekulu īpašībām locītavu skrimšļa matricā, kā arī II, IX un XI tipa kolagēna molekulas. Vienlaikus, tāpat kā citās suspensijas kultūrās, algināta lodīšu virsmā ir saplacinātas šūnas, kas rada nelielu daudzumu I tipa kolagēna molekulu, kuras tiek tieši atbrīvotas vidē un netiek iekļautas ECM. Algināta lodītēs novērojama mērena hondrocītu proliferācija. Pēc 8 mēnešu kultivēšanas algināta želejā nobrieduši hondrocīti nezaudē vielmaiņas aktivitāti un turpina sintezēt audu specifisko II tipa kolagēnu un aggrekānu.

H. Tanaka et al. (1984) pētīja dažādu dabisko molekulu difūzijas īpašības alginātā un atklāja, ka molekulas, kas lielākas par 70 kDa, neizdifundējas caur alginātu. Tādējādi šūnu kultūra alginātā ir piemērota matricas biosintēzes regulācijas un ECM organizācijas pētīšanai. Alginātā kultivētu šūnu pieejamība ļauj pētīt peptīdu regulējošo faktoru un farmakoloģisko aģentu darbību transkripcijas, posttranskripcijas un translācijas līmenī.

Hondrocītus kultivē arī I un II tipa kolagēna šķiedru matricā. S. Nehrers et al. (1997) salīdzināja suņu hondrocītu darbību porainās kolagēna-proteoglikāna polimēru matricās, kas satur dažāda veida kolagēnus. Viņi atklāja būtiskas atšķirības hondrocītu biosintēzes funkcijas morfoloģijā, kas kultivēti kolagēna matricās, kas satur I un II tipa kolagēnu. Šūnas II tipa kolagēna matricā saglabāja savu sfērisko formu, savukārt I tipa kolagēnā tām bija fibroblastiem līdzīga morfoloģija. Turklāt II tipa kolagēna matricā hondrocīti ražoja lielāku daudzumu glikozaminoglikānu. J. van Susante et al. (1995) salīdzināja algināta un kolagēna (I tipa) gelā kultivētu hondrocītu īpašības. Autori konstatēja ievērojamu šūnu skaita pieaugumu kolagēna gelā, bet no 6. kultivēšanas dienas šūnas zaudēja savu raksturīgo fenotipu, pārvēršoties fibroblastiem līdzīgās šūnās. Algināta gelā tika novērota šūnu skaita samazināšanās, bet hondrocīti saglabāja savu normālo fenotipu. Kolagēna želejā proteoglikānu skaits vienā šūnā bija ievērojami lielāks nekā alginātā, bet želejā, sākot ar 6. kultivēšanas dienu, tika novērota matricas elementu sintēzes samazināšanās, savukārt alginātā sintēze turpināja palielināties.

Cieta trīsdimensiju fibrīna matrica ir dabiska viela, kas atbalsta tajā suspendētus hondrocītus diferencētā fenotipā. Trīsdimensiju fibrīna matricu var izmantot arī kā nesēju hondrocītu transplantācijā. Fibrīna priekšrocības ir citotoksicitātes neesamība, spēja aizpildīt telpu un adhēzijas spēja. Histoloģiskie un bioķīmiskie pētījumi, autoradiogrāfija un elektronmikroskopija ir parādījuši, ka fibrīna gelā esošie hondrocīti saglabā savu morfoloģiju, proliferējas un veido matricu pat pēc 2 nedēļu kultivēšanas. Tomēr G. Homminga et al. (1993) ziņoja, ka fibrīna sadalīšanās sākas pēc 3 dienu kultivēšanas, un hondrocītu dediferenciācija progresē.

Hondrocītu suspensija mākslīgā (sintētiskā) ECM

Skrimšļa implantus rekonstruktīvai vai ortopēdiskai ķirurģijai var iegūt, audzējot izolētus hondrocītus in vitro sintētiskā bioloģiski saderīgā matricā.

Poliglikolskābē kultivētie hondrocīti proliferējas un saglabā normālu morfoloģiju un fenotipu 8 nedēļas. Hondrocītu-poliglikolskābes komplekss sastāv no šūnām, glikozaminoglikāniem, kolagēniem un tam ir ārēja kolagēna kapsula. Tomēr šādi implanti satur divu veidu kolagēna molekulas - I un II. Implantātos no hondrocītiem, kas dediferencēti ar virkni pasāžu, ir lielāks glikozaminoglikānu un kolagēna daudzums nekā implantos no primāri nediferencētiem hondrocītiem.

L. Frīds un līdzautori (1993b) salīdzināja cilvēka un liellopu hondrocītu kultūru uzvedību šķiedrainā poliglikolskābē (FPGA) un porainā polipienskābē (PPLA). Pēc 6–8 nedēļu ilgas liellopu hondrocītu kultivēšanas FPGA vai PPLA autori novēroja šūnu proliferāciju un skrimšļa matrices atjaunošanos. FPGA hondrocītiem bija sfēriska forma un tie atradās lakūnās, ko ieskauj skrimšļa matrice. Pēc 8 nedēļu ilgas in vitro kultivēšanas reģenerētie audi saturēja līdz 50 % sausnas (4 % šūnu masas, 15 % glikozaminoglikānu un 31 % kolagēna). PPLA šūnām bija vārpstveida forma un neliels daudzums glikozaminoglikānu un kolagēna. FPGA šūnu augšana bija 2 reizes intensīvāka nekā PPLA. In vivo VPGK un PPLC audzēti hondrocīti 1–6 mēnešu laikā producēja audus, kas histoloģiski bija līdzīgi skrimšļiem. Implantāti saturēja glikozaminoglikānus, I un II tipa kolagēnus.

Liellopu augļa hondrocītus kultivēja porainā augsta blīvuma hidrofobā un hidrofilā polietilēnā. Pēc 7 dienu inkubācijas abos substrātos šūnas saglabāja sfērisku formu un saturēja galvenokārt II tipa kolagēnu. Pēc 21 dienas kultivēšanas tika konstatēts, ka hidrofilā matrica satur vairāk II tipa kolagēna nekā hidrofobā matrica.

Skrimšļa audus var iegūt arī, kultivējot monoslānī uz Millicell-CM filtriem. Filtru iepriekšēja pārklāšana ar kolagēnu ir nepieciešama hondroitīnu piestiprināšanai. Kultūras histoloģiskā izmeklēšana liecina par hondrocītu uzkrāšanos ECM, kas satur proteoglikānus un II tipa kolagēnu. I tipa kolagēns šādā kultūrā netika konstatēts. Iegūtajos skrimšļa audos hondrocīti ir sfēriskas formas, bet uz audu virsmas tie ir nedaudz saplacināti. Jaunizveidoto audu biezums laika gaitā palielinājās un bija atkarīgs no šūnu monoslāņa sākotnējā blīvuma. Optimālos kultivēšanas apstākļos skrimšļa audu biezums sasniedza 110 μm, tā šūnu un kolagēna organizācija virspusējos un dziļajos slāņos ir līdzīga locītavu skrimšļa organizācijai. ECM satur aptuveni 3 reizes vairāk kolagēna un proteoglikānu. Pēc 2 nedēļu kultivēšanas tika novērota matricas uzkrāšanās, kas ļāva audus iegūt no filtra un izmantot transplantācijai.

Sims et al. (1996) pētīja hondrocītu kultivēšanu polietilēnoksīda želejā — iekapsulētā polimēru matricā, kas ļauj ar injekcijas palīdzību pārnest lielu skaitu šūnu. Sešas nedēļas pēc injekcijas atimisko peļu zemādas audos izveidojās jauns skrimslis, kam morfoloģiski raksturīga balta opalescence, kas līdzīga hialīna skrimšļiem. Histoloģiskie un bioķīmiskie dati liecināja par aktīvi proliferējošu hondrocītu klātbūtni, kas producē ECM.

Eksplantācija

Skrimšļa audu eksplantācija tiek izmantota, lai pētītu ana- un katabolisma procesus tajos, homeostāzes uzturēšanu, rezorbciju un atjaunošanos. Hondrocīti skrimšļa eksplantātos saglabā normālu fenotipu un ECM sastāvu, kas ir līdzīgs locītavu skrimšļa sastāvam in vivo. Pēc 5 dienu kultivēšanas seruma klātbūtnē tiek panākts nemainīgs sintēzes līmenis un dabiskie degradācijas procesi. Audu rezorbciju var paātrināt gan pamatkultūrā, gan kultūrā, pievienojot serumu, izmantojot vairākus līdzekļus, piemēram, IL-IB, TNF-α, baktēriju lipopolisaharīdus, retīnskābes atvasinājumus vai aktīvos skābekļa radikāļus. Lai pētītu skrimšļa reparāciju, tā bojājumus izraisa šķīstoši iekaisuma mediatori (H2O2 _,IL -1, TNF- α ) vai matricas fizisks plīsums.

Organotipiskās kultivēšanas metode ir modelis in vitro pētījumiem par izolētu ārējo faktoru ietekmi uz hondrocītiem un apkārtējo matricu. In vivo hondrocīti ir reti izvietoti ārējās membrānas (ECM) šūnās un nesaskaras viens ar otru. Locītavu skrimšļa eksplantāta kultūra saglabā šo strukturālo organizāciju, kā arī specifisko mijiedarbību starp hondrocītiem un apkārtējo ārpusšūnu vidi. Šo modeli izmanto arī, lai pētītu mehāniskā stresa, farmakoloģisko līdzekļu, augšanas faktoru, citokīnu un hormonu ietekmi uz skrimšļa metabolismu.

Vēl viena skrimšļa audu eksplantācijas priekšrocība ir hondrocītu bojājumu neesamība proteolītisko enzīmu vai mehānisko faktoru ietekmē, kas ir neizbēgami, izolējot šūnas. Receptori un citi membrānas proteīni un glikoproteīni ir aizsargāti no bojājumiem.

[ 17 ], [ 18 ], [ 19 ], [ 20 ], [ 21 ]

Hondrona kultūra

Hondrons ir locītavu skrimšļa strukturāla, funkcionāla un vielmaiņas vienība, kas sastāv no hondrocīta, tā pericelulārās matrices un kompaktas pavedienveida kapsulas un ir atbildīga par matricas homeostāzi. Hondroni tiek mehāniski iegūti no skrimšļa un savākti, izmantojot vairākas secīgas zema ātruma homogenizācijas. Hondronus, kas izolēti no dažāda skrimšļa dziļuma zonām, var iedalīt četrās kategorijās: viens hondrons, pāru hondroni, vairāki (trīs vai vairāk) lineāri sakārtoti hondroni (hondronu kolonnas) un hondronu klasteri.

Atsevišķi hondroni parasti atrodas neskarta skrimšļa vidējos slāņos, pāru hondroni atrodas vidējā un dziļā slāņa robežās, lineāri izvietoti vairāki hondroni ir raksturīgi neskarta skrimšļa dziļajiem slāņiem. Visbeidzot, hondronu klasteri sastāv no nejauši organizētām atsevišķu un pāru hondronu grupām, kas pēc homogenizācijas saglabā agregētu stāvokli. Hondronu klasteri ir lieli skrimšļa fragmenti, kas parasti satur vairākus hondronus un radiāli izvietotas kolagēna fibrillas, t.i., tipisku organizāciju, kas raksturīga matricas dziļajiem slāņiem. Hondroni ir imobilizēti caurspīdīgā agarozē, kas ļauj pētīt to struktūru, molekulāro sastāvu un vielmaiņas aktivitāti. Hondrona-agarozes sistēma tiek uzskatīta par skrimšļa mikromodeli, kas atšķiras no tradicionālās hondrocītu-agarozes sistēmas ar to, ka tiek saglabāta dabiskā mikrovide un nav nepieciešams to sintezēt un salikt. Hondronu kultūra ir modelis šūnu un matricas mijiedarbības pētīšanai locītavu skrimšļos normālos un patoloģiskos apstākļos.

[ 22 ], [ 23 ], [ 24 ], [ 25 ], [ 26 ], [ 27 ]

Nemirstīgo hondrocītu kultūra

Rekombinantās DNS vai onkogēnus saturošus vīrusus, kas spēj padarīt šūnu "nemirstīgu", izmanto, lai izveidotu pastāvīgas šūnu līnijas. Nemirstīgajiem hondrocītiem piemīt spēja bezgalīgi vairoties, saglabājot stabilu fenotipu. F. Mallein-Gerin et al. (1995) parādīja, ka SV40T onkogēns inducē peļu hondrocītu proliferāciju, kas turpina stabili ekspresēt II, IX un XI tipa kolagēnu, kā arī locītavu agrekānu un saistošo proteīnu. Tomēr šāda šūnu līnija iegūst spēju sintezēt I tipa kolagēnu, kultivējot to monoslāņa kultūrā vai agarozes želejā.

V. Hortons un līdzautori (1988) aprakstīja nemirstīgu šūnu līniju ar zemu II tipa kolagēna mRNS ekspresijas līmeni. Šīs šūnas tika iegūtas, transformējot tās ar peles retrovīrusu, kas satur I-myc- un y-ra-onkogēnus. Šāda veida šūnas ir unikāls modelis locītavu matrices mijiedarbības izpētei bez II tipa kolagēna, kā arī II tipa kolagēna sintēzes regulācijas izpētei.

Hondroprītu ar mutētiem vai dzēstiem gēniem kultivēšana ir ērts modelis to fizioloģiskās funkcijas pētīšanai. Šis modelis ir īpaši piemērots, lai pētītu specifisku molekulu lomu skrimšļa matrices organizācijā vai dažādu regulējošo faktoru ietekmi uz skrimšļa metabolismu. Hondrocīti ar dzēstu IX tipa kolagēna gēnu sintezē kolagēna fibrillas, kas ir platākas nekā parasti, norādot, ka IX tipa kolagēns regulē fibrilu diametru. Kā minēts 1. nodaļā, ģimenēs ar primāru ģeneralizētu osteoartrītu nesen ir atklāta mutācija COLAI gēnā, kas kodē II tipa kolagēnu. Lai pētītu mutanta II tipa kolagēna ietekmi uz locītavu matricu, R. Dharmrvaram et al. (1997) in vitro transfektēja (inficēja ar svešu nukleīnskābi) defektīvu COL ₂ AI (arginīns 519. pozīcijā ir aizstāts ar cisteīnu) cilvēka augļa hondrocītos.

Kokultūras sistēma. Locītavā skrimslis mijiedarbojas ar cita veida šūnām, kas atrodas sinoviālajā membrānā, sinoviālajā šķidrumā, saitēs un subhondrālajā kaulā. Hondrocītu metabolismu var ietekmēt dažādi šķīstoši faktori, ko sintezē uzskaitītās šūnas. Tādējādi artrīta gadījumā locītavu skrimšļus iznīcina proteolītiskie enzīmi un brīvie radikāļi, ko ražo sinoviālās šūnas. Tāpēc ir izstrādāti modeļi, lai pētītu sarežģītu mijiedarbību starp skrimšļiem un apkārtējiem audiem, ko sauc par kokultūrām.

S. Lacombe-Gleise et al. (1995) kultivēja trušu hondrocītus un osteoblastus kopkultūras sistēmā (COSTAR), kurā šūnas bija atdalītas ar mikroporainu membrānu (0,4 μm), kas ļāva apmainīties starp abiem šūnu tipiem bez tieša kontakta. Šis pētījums parādīja osteoblastu spēju stimulēt hondrocītu augšanu, izmantojot šķīstošus mediatorus.

AM Malfait un līdzautori (1994) pētīja perifēro asiņu monocītos un hondrocītos esošo saistību. Šis modelis ir ērts citokīnu mediētu procesu izpētei iekaisuma artropātijās (reimatoīdais artrīts, seronegatīvi spondiloartrīti u.c.). Modeļa autori atdalīja šūnas ar proteīnus saistošu membrānu ar porām 0,4 μm diametrā. Pētījums parādīja, ka ar lipopolisaharīdu stimulēti monocīti producēja IL-1 un TNF-α, kas kavē agrekāna sintēzi hondrocītos un veicina jau sintezētu agrekāna agregātu noārdīšanos.

K. Tada et al. (1994) izveidoja kopkultūras modeli, kurā endotēlija šūnas kolagēna (I tipa) gelā tika ievietotas iekšējā kamerā, kas no ārējās kameras tika atdalīta, un hondrocīti tajā tika ievietoti ar filtru ar poru izmēru 0,4 μm. Pilnībā izolētas no ārējās kameras, cilvēka endotēlija šūnas veidoja caurulītes kolagēna gelā EGF vai TGF-α klātbūtnē. Kad abi šūnu veidi tika kultivēti vienlaicīgi, TGF-α atkarīgā caurulīšu veidošanās endotēlija šūnās tika kavēta. Šī procesa kavēšanu hondrocītos daļēji novērsa anti-TGF-beta antivielas. Var pieņemt, ka hondrocītu producētais TGF-beta kavē paša skrimšļa vaskularizāciju.

S. Groot et al. (1994) vienlaicīgi kultivēja hondrocītus no 16 dienas veca peles augļa kaulu hipertrofiskajām un proliferatīvajām zonām ar smadzeņu audu gabaliņiem. Pēc 4 kultivēšanas dienām tika novērota hondrocītu transdiferenciācija osteoblastos un osteoīdu veidošanās sākums. Pēc 11 kultivēšanas dienām daļa skrimšļa bija aizstāta ar kaulu audiem, un kaulu matrica bija daļēji kalcificēta. Daži smadzeņu audu ražotie neiropeptīdi un neirotransmiteri ietekmē osteoblastu metabolismu vai tiem ir receptori. Starp tiem ir norepinefrīns, vazoaktīvais zarnu peptīds, ar kalcitonīna gēnu saistītais peptīds, viela P un somatostatīns. Smadzeņu audu gabali, kas kultivēti kopā ar hondrocītiem, var radīt dažus no uzskaitītajiem faktoriem, kas spēj inducēt hondrocītu transdiferenciācijas procesu osteoblastos.

[ 28 ], [ 29 ], [ 30 ], [ 31 ], [ 32 ], [ 33 ]

Ārējo faktoru ietekme uz hondrocītu kultūru

Skābekļa sprieguma ietekme uz hondrocītu metabolismu

Vairumā gadījumu hondrocītu kultūras attīstās atmosfēras skābekļa spiediena apstākļos. Tomēr ir labi zināms, ka in vivo hondrocīti pastāv hipoksiskos apstākļos, un skābekļa spiediens mainās dažādos patoloģiskos apstākļos. Nobriešanas procesā tiek novērotas būtiskas izmaiņas epifīžu asinsapgādē. Tā kā vaskularizācija dažādās augšanas plāksnes zonās atšķiras, mainās arī skābekļa spiediens tajās. C. Braitons un R. Hepenstalls (1971) pierādīja, ka trušu stilba kaula plātnē skābekļa spiediens hipertrofiskajā zonā ir zemāks nekā apkārtējā skrimšļa zonā. Dažu vielmaiņas parametru mērījumi parādīja, ka hondrocīti spēj ātri reaģēt uz lokālām skābekļa koncentrācijas izmaiņām. Pirmkārt, pie zema skābekļa sprieguma tā patēriņš hondrocītos samazinās. Samazinoties skābekļa spriegumam no 21 līdz 0,04%, palielinās glikozes izmantošana, palielinās glikolītisko enzīmu aktivitāte un pienskābes sintēze. Pat pie zema skābekļa sprieguma ATP, ADP un AMP absolūtais daudzums saglabājas stabils. Šie dati liecina, ka hondrocītu metabolisms ir vērsts uz maksimālu enerģijas saglabāšanu. Tomēr sintētiskā aktivitāte un līdz ar to arī reparācijas procesi mainās hipoksiskos apstākļos.

Augsts skābekļa spiediens ietekmē arī hondrocītu metabolismu, izraisot proteoglikānu un DNS sintēzes samazināšanos un skrimšļa matrices degradāciju. Šīs sekas parasti pavada brīvo skābekļa radikāļu veidošanās.

Jonu koncentrācijas un vides osmotiskā spiediena ietekme uz hondrocītu funkciju

Dabīgajos skrimšļos jonu koncentrācija būtiski atšķiras no koncentrācijas citos audos: nātrija saturs ekstracelulārajā vidē ir 250–350 mmol, un tā osmolaritāte ir 350–450 mosmol. Kad hondrocītus izolē no ECM un inkubē standarta vidē (DMEM (Dulbecco minimālā nepieciešamā vide), osmolaritāte ir 250–280,7 mosmol), šūnu apkārtējā vide ievērojami mainās. Turklāt kalcija un kālija koncentrācija standarta vidē ir ievērojami zemāka nekā dabīgajos audos, un anjonu koncentrācija ir ievērojami augstāka.

^{Saharozes pievienošana barotnei palielina tās osmolaritāti un izraisa pārejošu H +} un kalcija anjonu koncentrācijas intracelulāru palielināšanos citozolā. Šādas intracelulāras izmaiņas var ietekmēt hondrocītu diferenciācijas procesus un to metabolisma aktivitāti. J. Urban et al. (1993) atklāja, ka 358-sulfāta un 3H-prolīna iekļaušana ^izolētos hondrocītos ^, kas inkubēti standarta DMEM 2-4 stundas, bija tikai 10% no tā, kas ir dabiskos audos. Sintēzes intensitāte sasniedza maksimumu pie ekstracelulārās vides osmolaritātes 350-400 mosmol gan svaigi izolētos hondrocītos, gan skrimšļa audu eksplantātos. Turklāt hondrocītu tilpums palielinājās par 30-40% pēc izolēto šūnu ievietošanas standarta DMEM ar noteiktu osmolaritāti. Tomēr, kultivējot hondrocītus nefizioloģiskas osmolaritātes apstākļos 12-16 stundas, šūnas pielāgojas jaunajiem apstākļiem, samazinot biosintēzes intensitāti proporcionāli ekstracelulārās vides osmolaritātes izmaiņām.

P. Borgetti et al. (1995) pētīja ārpusšūnu vides osmolaritātes ietekmi uz cūku hondrocītu augšanu, morfoloģiju un biosintēzi. Autori pierādīja līdzīgas hondrocītu bioķīmiskās un morfoloģiskās īpašības, kas kultivētas vidē ar osmolaritāti 0,28 un 0,38 mosmol. Pie vidējas osmolaritātes 0,48 mosmol pirmajās 4-6 kultivēšanas stundās tika novērota šūnu proliferācijas un olbaltumvielu sintēzes samazināšanās, bet šie parametri vēlāk atjaunojās un galu galā sasniedza kontroles vērtības. Kad hondrocītus kultivēja vidē ar osmolaritāti 0,58 mosmol, šūnas zaudēja spēju uzturēt proliferācijas procesu fizioloģisko intensitāti, un pēc 6 dienām hondrocītu skaits bija ievērojami samazināts. Pie vidējas osmolaritātes 0,58 mosmol tika novērota izteikta olbaltumvielu sintēzes inhibīcija. Turklāt, kultivējot vidē ar osmolaritāti 0,28-0,38 mOsm, hondrocīti saglabā savu fizioloģisko fenotipu; pie augstākas osmolaritātes (0,48–0,58 mOsm) notiek būtiskas izmaiņas šūnu morfoloģijā, kas izpaužas kā raksturīgā fenotipa zudums, hondrocītu pārveidošanās par fibroblastiem līdzīgām šūnām un šūnu spējas zudums veidot matricas proteoglikānus. Šī pētījuma rezultāti liecina par hondrocītu spēju reaģēt uz ierobežotām svārstībām ekstracelulārās vides osmolaritātē.

Arī citu jonu koncentrācijas izmaiņas var ietekmēt biosintēzes procesus hondrocītos. Tādējādi ^35S (sulfāta) iekļaušanas pakāpe palielinās uz pusi, palielinoties kālija jonu koncentrācijai no 5 mmol (koncentrācija standarta DM EM vidē) līdz 10 mmol (koncentrācija ECM in vivo). Kalcija koncentrācija zem 0,5 mmol veicināja kolagēna veidošanos nobriedušos liellopu hondrocītos, savukārt koncentrācija 1-2 mmol (atbilst koncentrācijai standarta DM EM vidē) izraisīja ievērojamu kolagēna sintēzes samazināšanos. Pie augsta kalcija līmeņa (2-10 mmol) tika novērots mērens biosintēzes pieaugums. Hondrocītu piesaistē ECM olbaltumvielām piedalās dažādi katjoni. Tādējādi magnija un mangāna joni nodrošina piesaisti fibronektīnam un II tipa kolagēnam, savukārt kalcija joni nepiedalās hondrocītu piesaistē olbaltumvielām. Tādējādi aprakstīto pētījumu rezultāti norāda uz kālija, nātrija, kalcija ekstracelulāro jonu un barotnes osmolaritātes izmaiņu ietekmi uz standarta vidē inkubētu hondrocītu biosintēzes funkciju.

Mehāniskā stresa ietekme uz hondrocītu metabolismu

Locītavu imobilizācija izraisa atgriezenisku skrimšļa atrofiju, kas norāda uz mehānisku stimulu nepieciešamību normāliem vielmaiņas procesiem ārpusšūnu masā (EKM). Vairumā gadījumu izmantotie šūnu kultūru modeļi pastāv normālā atmosfēras spiedienā. M. Wright et al. (1996) parādīja, ka mehāniskā vide ietekmē hondrocītu vielmaiņu, šūnu reakcija ir atkarīga no kompresīvās slodzes intensitātes un biežuma. Eksperimenti ar slodzi uz neskartiem locītavu skrimšļiem in vitro parādīja olbaltumvielu un proteoglikānu sintēzes samazināšanos statiskās slodzes iedarbībā, savukārt dinamiskā slodze stimulē šos procesus. Precīzi mehāniskās slodzes ietekmes uz skrimšļiem mehānismi ir sarežģīti un, iespējams, ir saistīti ar šūnu deformāciju, hidrostatisko spiedienu, osmotisko spiedienu, elektrisko potenciālu un virsmas šūnu receptoriem matricas molekulām. Lai pētītu katra no šiem parametriem ietekmi, ir jāizveido sistēma, kurā vienu parametru var mainīt neatkarīgi. Piemēram, eksplantāta kultūra nav piemērota šūnu deformācijas pētīšanai, bet to var izmantot, lai pētītu spiediena vispārējo ietekmi uz hondrocītu vielmaiņas aktivitāti. Skrimšļa saspiešana noved pie šūnu deformācijas, un to pavada arī hidrostatiskā spiediena gradienta, elektriskā potenciāla, šķidruma plūsmas rašanās un izmaiņas tādos fizikāli ķīmiskajos parametros kā ūdens saturs matricā, elektriskā lādiņa blīvums un osmotiskā spiediena līmenis. Šūnu deformāciju var pētīt, izmantojot izolētus hondrocītus, kas iegremdēti agarozes vai kolagēna želejā.

Ir izstrādātas vairākas sistēmas, lai pētītu mehāniskās stimulācijas ietekmi uz hondrocītu kultūru. Daži pētnieki izmanto sistēmas, kurās spiediens uz šūnu kultūru tiek pielikts caur gāzveida fāzi. Piemēram, JP Veldhuijzen et al. (1979), izmantojot spiedienu 13 kPa virs atmosfēras spiediena ar zemu frekvenci (0,3 Hz) 15 minūtes, novēroja cAMP un proteoglikānu sintēzes palielināšanos un DNS sintēzes samazināšanos. R. Smith et al. (1996) parādīja, ka primāro liellopu hondrocītu kultūras periodiska pakļaušana hidrostatiskajam spiedienam (10 MPa) ar frekvenci 1 Hz 4 stundas izraisīja aggrekāna un II tipa kolagēna sintēzes palielināšanos, savukārt nemainīgs spiediens neietekmēja šos procesus. Izmantojot līdzīgu sistēmu, Wright et al. (1996) ziņoja, ka ciklisks spiediens uz šūnu kultūru ir saistīts ar hondrocītu šūnu membrānas hiperpolarizāciju un Ca2 ⁺ atkarīgo kālija kanālu aktivāciju. Tādējādi cikliskā spiediena ietekmi mediē stiepšanās aktivizēti jonu kanāli hondrocītu membrānā. Hondrocītu reakcija uz hidrostatisko spiedienu ir atkarīga no šūnu kultivēšanas apstākļiem un pielietotās slodzes frekvences. Tādējādi ciklisks hidrostatiskais spiediens (5 MPa) samazina sulfātu iekļaušanu hondrocītu monoslānī ar frekvenci 0,05, 0,25 un 0,5 Hz, savukārt frekvencē, kas lielāka par 0,5 Hz, sulfātu iekļaušana skrimšļa eksplantā palielinās.

M. Bušmans un līdzautori (1992) ziņoja, ka hondrocīti agarozes želejās maina biosintēzi, reaģējot uz statisku un dinamisku mehānisku slodzi, tāpat kā kultivēts neskarts orgāns. Autori atklāja, ka mehāniskā slodze rada hiperosmotisku stimulu, kam seko pH līmeņa pazemināšanās hondrocītos.

Mehāniskās stiepšanas ietekmi var pētīt uz šūnu kultūru, kas iegremdēta želejā. Stiepšanas spēku var radīt, izmantojot datora kontrolētu vakuumu. Kad sistēma atrodas noteiktā vakuuma pakāpē, Petri trauciņa apakšdaļa ar šūnu kultūru tiek pagarināta par zināmu daudzumu, deformācija ir maksimāla trauciņa apakšdaļas malās un minimāla centrā. Stiepums tiek pārnests arī uz Petri trauciņā kultivētajiem hondrocītiem. Izmantojot šo metodi, K. Holm-vall et al. (1995) parādīja, ka hondrosarkomas šūnās, kas kultivētas kolagēna (II tipa) želejā, palielinās α2β-integrīna mRNS ekspresija _{. β2β-integrīns} spēj _saistīties ar II tipa kolagēnu. Tas tiek uzskatīts par mehānoreceptoru, jo tas mijiedarbojas ar aktīnu saistošiem proteīniem, tādējādi savienojot ECM un citoskeletu.

PH ietekme uz hondrocītu metabolismu

Skrimšļa audu ECM intersticiālā šķidruma pH ir skābāks nekā citos audos. A. Maroudas (1980) noteica locītavu skrimšļa matrices pH kā 6,9. B. Diamant et al. (1966) patoloģiskos apstākļos konstatēja pH 5,5. Ir zināms, ka hondrocīti dzīvo zemā PO2 līmenī, kas norāda uz glikolīzes (95% no visa glikozes metabolisma) svarīgo lomu šo šūnu metabolismā; glikolīzi pavada liela daudzuma pienskābes ražošana.

Papildus vides paskābināšanai ar glikolīzes produktiem, liela nozīme ir pašiem matricas komponentiem. Lielais fiksētā negatīvā lādiņa daudzums uz proteoglikāniem maina ekstracelulāro jonu sastāvu: tiek novērota augsta brīvo katjonu koncentrācija (piemēram, H ⁺, Na ⁺, K ⁺ ) un zema anjonu koncentrācija (piemēram, O2, HCO3). Turklāt mehāniskas slodzes ietekmē no ECM tiek izspiests ūdens, kas noved pie fiksēto negatīvo lādiņu koncentrācijas palielināšanās un lielāka katjonu skaita piesaistes matricai. To pavada ekstracelulārās vides pH samazināšanās, kas ietekmē intracelulāro pH, tādējādi mainot hondrocītu metabolismu. R. Vilkins un A. Hols (1995) pētīja ekstracelulārās un intracelulārās vides pH ietekmi uz matricas biosintēzi izolētos liellopu hondrocītos. Viņi novēroja divkāršu matricas sintēzes modifikāciju, samazinoties pH līmenim. Neliela pH samazināšanās (7,4 < pH < 7,1) par 50 % palielināja 35SO4 un 3H-prolīna iekļaušanu ^hondrocītos, ^savukārt_dziļāka barotnes paskābināšana (pH < 7,1) kavēja sintēzi par 75 % salīdzinājumā ar kontroli. Zema pH (6,65) izveide, izmantojot amonija jonus, izraisīja matricas sintēzes samazināšanos tikai par 20 %. Iegūtie rezultāti liecina, ka matricas sintēzes ekstracelulārās vides pH izmaiņas nevar izskaidrot tikai ar intracelulārās vides pH izmaiņām. Turklāt hondrocītiem piemīt spēja regulēt intracelulāro pH, izmantojot Na ⁺, H ⁺ -apmainītāju, Ka ⁺ -atkarīgo Cl_ ^- НСОС3-transporteru un H ⁺ /ATPāzi.

[ 34 ], [ 35 ], [ 36 ], [ 37 ], [ 38 ], [ 39 ], [ 40 ]

Barotnes sastāva ietekme uz hondrocītu metabolismu

Hondrocītu kultivēšanas videi jāatbilst eksperimenta apstākļiem. Pēdējos gados kultivēšanas apstākļu optimizēšanai tiek izmantots teļa serums. Tomēr, lietojot serumu, jāņem vērā vairāki svarīgi punkti:

• šūnu augšana no audu perifērijas orgānu kultūrās,
• dažādu sēriju serumu sastāva mainīgums,
• nezināmu sastāvdaļu klātbūtne tajos,
• paaugstināts traucējumu un artefaktu risks, pētot dažādu bioloģisko faktoru ietekmi uz šūnu vielmaiņas aktivitāti.

Pēdējā minētā piemērs ir pētījums par EGF ietekmi uz skrimšļa hondrocītiem žurkām. EGF stimulēja ^3H -timidīna iekļaušanu un DNS satura palielināšanos kultūrā. Šis efekts bija izteiktāks zemās seruma koncentrācijās (<1%), bet augstās koncentrācijās (>7,5%) efekts izzuda.

Ir labi zināms, ka sintēzes un degradācijas līmeņi DMEM, kas papildināta ar teļa serumu, ir ievērojami paaugstināti, salīdzinot ar in vivo apstākļiem. Atšķirības starp metabolismu in vivo un in vitro var būt saistītas ar atšķirībām starp sinoviālo šķidrumu un vidi, kurā šūnas tiek kultivētas. Lī un līdzautori (1997) kultivēja jaunus liellopu hondrocītus agarozē, izmantojot barības vielu barotni, kas saturēja DMEM, kas papildināta ar 20% teļa seruma un lielu daudzumu normāla allogēna sinoviālā šķidruma. Sinoviālā šķidruma klātbūtne vidē izraisīja proteoglikānu daudzuma palielināšanos līdz pat 80% no kopējā sinoviālā šķidruma daudzuma. Šie rezultāti liecina, ka sinoviālais šķidrums kultūrā izraisa metabolisma līmeni, kas līdzīgs in vivo, ar augstu glikozaminoglikānu sintēzes līmeni un zemu šūnu dalīšanās līmeni.

G. Verbruggens u.c. (1995) parādīja, ka cilvēka hondrocītu, kas kultivēti agarozes vidē bezseruma DMEM, ^35S -arrpeKaHa sintēze bija 20–30 % no sintēzes līmeņa, kas novērots DMEM vidē, kas papildināta ar 10 % teļa seruma. Autori noteica, cik lielā mērā IGF-1, IGF-2, TGF-R vai insulīns atjaunoja aggrekāna ražošanu bezseruma vidē. Autori secināja, ka 100 ng/ml insulīna, IGF-1 vai IGF-2 daļēji atjaunoja aggrekāna sintēzi līdz 39–53 % no kontroles līmeņa. Kombinējot uzskaitītos faktorus, netika novērots sinerģisms vai kumulācija. Tajā pašā laikā 10 ng/ml TGF-R 100 ng/ml insulīna klātbūtnē stimulēja aggrekāna sintēzi līdz 90 % vai vairāk no atsauces līmeņa. Visbeidzot, cilvēka seruma transferīns, atsevišķi vai kombinācijā ar insulīnu, neietekmēja aggrekāna sintēzi. Kad teļa serumu aizstāja ar liellopu seruma albumīnu, agrekāna agregātu saturs ievērojami samazinājās. Barotnes bagātināšana ar insulīnu, IGF vai TGF-R daļēji atjaunoja šūnu spēju producēt agrekāna agregātus. Turklāt IGF-1 un insulīns spēj uzturēt homeostāzi šūnu kultūrās. Pēc 40 dienu kultivēšanas vidē, kas bagātināta ar 10-20 ng/ml IGF-1, proteoglikāna sintēze saglabājās tādā pašā līmenī vai pat augstākā salīdzinājumā ar vidi, kas saturēja 20% teļa seruma. Kataboliskie procesi vidē, kas bagātināta ar IGF-1, noritēja lēnāk nekā vidē, kas bagātināta ar 0,1% albumīna šķīdumu, bet nedaudz ātrāk vidē, kas bagātināta ar 20% seruma. Ilgmūžīgās kultūrās 20 ng/ml IGF-1 uztur stabilu šūnu stāvokli.

D. Lī un līdzautori (1993) salīdzināja barotnes sastāva (DMEM, DMEM+20% teļa serums, DMEM+20 ng/ml IGF-1) ietekmi uz DNS sintēzi skrimšļa audu eksplantāta kultūrā, monoslāņa kultūrā un agarozes suspensijā. Kultivējot agarozē seruma klātbūtnē, autori novēroja hondrocītu tendenci grupēties lielos klasteros. Šūnas, kas kultivētas bez seruma vai ar IGF-1, agarozē saglabāja apaļu formu, savāktas mazās grupās, bet neveidoja lielus agregātus. Monoslānī DNS sintēze bija ievērojami augstāka serumu saturošā vidē nekā vidē, kas bagātināta ar IGF-1; DNS sintēze pēdējā bija ievērojami augstāka nekā nebagātinātā vidē. Netika konstatētas atšķirības DNS sintēzē, kultivējot hondrocītus agarozes suspensijā nebagātinātā vidē un vidē ar IGF-1. Vienlaikus hondrocītu suspensiju kultivēšana agarozē serumā bagātinātā vidē bija saistīta ar palielinātu radionukleotīda ^3H -timidīna iekļaušanu salīdzinājumā ar citām vidēm.

C vitamīns ir nepieciešams fermentu aktivizēšanai, kas iesaistīti stabilas spirālveida kolagēna fibrilu struktūras veidošanā. Hondrocīti, kuriem trūkst askorbīnskābes, sintezē nepietiekami hidroksilētus nespirālveida kolagēna prekursorus, kas tiek sekretēti lēni. Askorbīnskābes (50 μg/ml) ievadīšana izraisa II un IX tipa kolagēna hidroksilēšanu un to sekrēciju normālā daudzumā. C vitamīna pievienošana neietekmēja proteoglikānu sintēzes līmeni. Tādēļ kolagēna sekrēcija tiek regulēta neatkarīgi no proteoglikānu sekrēcijas.

[ 41 ], [ 42 ], [ 43 ], [ 44 ], [ 45 ], [ 46 ], [ 47 ]