Raksta medicīnas eksperts
Jaunas publikācijas
Osteoartrīta eksperimentālie modeļi
Pēdējā pārskatīšana: 18.10.2021
Visi iLive saturs ir medicīniski pārskatīts vai pārbaudīts, lai nodrošinātu pēc iespējas lielāku faktisko precizitāti.
Mums ir stingras iegādes vadlīnijas un tikai saikne ar cienījamiem mediju portāliem, akadēmiskām pētniecības iestādēm un, ja vien iespējams, medicīniski salīdzinošiem pārskatiem. Ņemiet vērā, ka iekavās ([1], [2] uc) esošie numuri ir klikšķi uz šīm studijām.
Ja uzskatāt, ka kāds no mūsu saturiem ir neprecīzs, novecojis vai citādi apšaubāms, lūdzu, atlasiet to un nospiediet Ctrl + Enter.
Skrimšļi ir ļoti specializēti audi, kas satur tikai vienu šūnu tipu (hondrocītus), kam raksturīga asiņu un limfātisko asiņu trūkums. Krambiņas uzturu galvenokārt veic absorbcija no sinoviālā šķidruma. Hondrokītu metabolismu regulē vairāki šķīstošie faktori, ko vietēji ražo hondrocīti un apkārtējie audi. Hondrocītu funkcija arī ir atkarīga no sastāva ārpusšūnu barotnē (skābekļa spiediena, jonu koncentrācijas, pH, utt), Ar VCR sastāvu, mijiedarbību ar šūnu un matricas fizisko signāliem. Eksperimentālās modelēšanas galvenais uzdevums ir veidot kultūras ārpusšūnu vidē, nemainot nobriedušu šūnu fenotipu. Otrais uzdevums ir radīt kultūru, lai pētītu ķermeņa un / vai fizisko signālu priekšlaicīgu, aizkavētu, īslaicīgu vai ilgtermiņa reakciju hondrocītos. Pētījumi in vitro arī sniegt iespēju studēt uzvedību hondrocītu osteoartrīts. Trešais uzdevums ir tādu ārstniecisku sistēmu izstrāde, kas ļauj pētīt dažādu audu mijiedarbību locītavā. Ceturtais uzdevums ir kramtveida implantu sagatavošana vēlākai transplantācijai. Un, visbeidzot, piektais mērķis - pētījums par augšanas faktoru, citokīnu vai zālēm, var veicināt šo remontu un / vai kavē uzsūkšanos tās skrimšļiem.
Pēdējo desmit gadu laikā, radīja dažādus modeļus locītavu skrimšļa šūnu kultūrām, starp tiem - monoslāņi, apturēta kultūrā, kultūras hondronov, explants, coculture, nemirstīgu šūnu kultūrā. Katrai kultūrai ir savas priekšrocības un trūkumi, un katra no tām ir piemērota, lai pētītu vienu konkrētu hondrocītu metabolismu. Tādējādi, kastrētus ekspertīzes ir lielisks paraugs matrices elementu aprites pētīšanai, kas prasa īstas šūnu virsmas receptorus un normālu šūnu matricu un matricu-šūnu mijiedarbību. Tajā pašā laikā ieteicams pētīt nogulsnes matricā vai mehānismus hondrocītu metabolīta regulēšanai izolētu šūnu kultūrā. Šūnu diferenciācijas procesa pētīšanai ir nepieciešama monolīda zema blīvuma kultūra. Dabā vai sintētiskā matricā suspendētās kultūras ir paraugs hondrocītu adaptīvās reakcijas analīzei mehāniskajā spriegumā.
Hondrocītu kultūras
Izvēloties skrimšļa audus in vitro pētījumos, jāņem vērā vairāki svarīgi punkti. Hondrocītu matrices sastāvs un vielmaiņas aktivitāte dažādās locītavās atšķiras, un pēdējais arī ir atkarīgs no hondrocīta dziļuma audos. Šie dati tika iegūti vairākos eksperimentos, kuros pētīja izolētas apakšgrupas hondrocītus no dažādu dziļumu skrimšļu zonām. Tika konstatētas vairākas morfoloģiskās un bioķīmiskās atšķirības starp kultivētajām hondrocītām, kas atrodas virsmas un dziļa locītavas skrimšļa slāņos. Virsmas šūnas sintezē retu, noplicinātu proteoglikāna fibrilāru matricu, savukārt dziļākās šūnas veido matricu, kas bagāta ar šķiedrām un proteoglikāniem. Turklāt virsmas šūnas ražo relatīvi mazus neagregētus proteoglikanus un hialuronskābi, un salīdzinoši mazāk aggrecan un keratāna sulfātu nekā dziļāk izvietotās hondrocītes. Vēl viena svarīga atšķirības iezīme hondrocītu, kas izolēti no dažāda dziļuma skrimšļu zonām, metabolisma ir atbilde uz eksogēno stimulu. Pēc M. Aidelottes un līdzautoru domām, buļļu hondrocīti no skrimšļa virsmas zonas bija jutīgāki pret IL-1 nekā dziļās zonas šūnas.
Šūnu uzvedība ir atkarīga arī no audu atrašanās vietas. Hondrocītus skrimšļu un ausu malas, kas ņemti no viena dzīvnieka, kas atšķirīgi reaģē uz augšanas faktoriem, piemēram, fibroblastu augšanas faktora (FGF), un TGF-beta. FGF palielināja timidīna, prolīna un leikīna iekļaušanos ribas hondrocīta kultūrā, bet ne ausī. TGF-P palielināja inkorporāciju inkorporēšanos stāšanās skrimšļi hondrocītus ribas un auss, bet neietekmēja timidīnfosforilāzes inkorporācijas hondrocītu un prolīna auss. Ķiršu šūnas, kas iegūtas no zonām, kurām ir vislielākā slodze, atšķiras no vietnēm ar zemu slodzi uz skrimšļiem. Piemēram, nobriedušu hondrocītus no skrimšļa ceļa locītavas no centrālās reģiona aitas locītavu tibiālā kaulu virsmas neattiecas menisku, kas veic vislielāko slodzi in vivo, mazāku Sintētisku aggrecan, decorin bet lielāks nekā šūnās jomās, uz kurām attiecas menisku. Sintētiskās locītavu funkcijas pārbaudot, autori uzsver arī to, ka ir svarīgi izmantot skrimšļus no identiskām locītavu zonām.
Hondrocītu metabolisms un to reakcija uz regulējošiem faktoriem arī būtiski ir atkarīga no donora vecuma, tās skeleta attīstības un locītavu stāvokļa, no kuras šūnas tiek ņemtas. Cilvēka hondrocītos novērota ievērojama proliferatīvās atbildes reakcijas samazināšanās ar vecumu. Lielākais samazinājums vērojams donoriem vecumā no 40 līdz 50 gadiem un vecākiem par 60 gadiem. Turklāt proliferatīvās atbildes reakcija uz augšanas faktoriem (piemēram, FGF un TGF-beta) smaguma pakāpes laikā samazinās. Papildus kvantitatīvajām izmaiņām hondrocītu izplatīšanā ir arī kvalitatīvas izmaiņas. Jaunas donoru šūnas (10 - 20 gadus vecas) labāk reaģē uz trombocītu augšanas faktoru (PDGF) nekā pret TGF-beta, savukārt pretēji ir novērotas pieaugušo donoru šūnās. Lai izskaidrotu vecuma izmaiņas hondrocītu sintētiskajā funkcijā un to reakciju uz augšanas faktoru ietekmi, tiek izmantoti vairāki mehānismi. To vidū ir virszemes šūnu receptoru skaita un afinitātes samazināšanās, augšanas faktoru un citokīnu sintēzes un bioaktivitātes izmaiņas, postreceptoru signālu pārveidošana.
Šūnu patoloģiskais stāvoklis arī maina hondrocītu morfoloģiju un metabolisko aktivitāti. Tātad J. Kouri un līdzautori (1996) noteica trīs hondrocītu apakšgrupas ar skrimšļiem ar osteoartrītu. Hrontiskās virsmas no skrimšļa vidusdaļas veidojas kā kopas un sintezē vairāk proteoglikānu un kolagēna. TGF-beta, un insulīnam līdzīgais augšanas faktors (IGF) var stimulēt GAG sintēzi ar hondrocītu un daļēji neitralizēt ietekmi IL-1 un TNF-a. Skrimšļa explants Inficēti tika ar osteoartrītu, un hondrocītu izolēta no skrimšļa pacientiem ar osteoartrītu, ir vairāk jutīgas pret stimulāciju TGF-beta nekā veselie skrimšļa hondrocītu. Šīs atšķirības, visticamāk, ir saistītas ar fenotipiskām izmaiņām hondrocītos salikles skrimšļa augšējos slāņos.
Atsevišķu hondrocītu izolēšana tiek panākta, secīgi apstrādājot ar ECM proteolītiskiem fermentiem. Pēc atbrīvošanas no ECM, izolētās šūnas ideāli piemērotas de novo matricas komponentu sintēzei . Daži autori lieto tikai klostridija kolagēzi, citi pirms inkubē skrimšļus ar tripsīnu, prozažu, DNāzu un / vai hialuronidāzi. Izolēto šūnu skaits ir atkarīgs no izmantotajiem fermentiem. Tādējādi, kad apstrādājot viens no 1 g kolagenāzes audos var iegūt 1,4T0 6 hondrocītus, bet, ja izmanto pronase, hyaluronidase un kolagenāzes - 4,3-10 6. Apstrādājot ar kolagēziātu, aggrecan, olbaltumvielas, IL-6, IL-8 saglabājas šūnu kultūrā daudz vairāk nekā tad, ja tiek veikta secīga ārstēšana ar dažādiem fermentiem. Šīm atšķirībām starp abām šūnu kultūrām ir vairāki paskaidrojumi:
- Šūnu receptoriem bojātas vai depresija, iedarbojoties ar fermentu, TGF-beta inhibē DNS sintēzi, proteoglikānu, kas ir nesen izolētām hondrocītu (1 diena), kamēr DNS un proteoglikānu sintēzi hondrocītu kultivētas vienslāņa (7 dienas), ko stimulēs TGF-beta. Tomēr, lai reekspresētu šos membrānas komponentus, pirms eksperimenta sākuma ir nepieciešams pietiekams laiks.
- Eksogēnās proteāzes var izjaukt mijiedarbību starp šūnām un matricu, ko mediē integrīni. Integrīna ģimene veicina hondrocītu piestiprināšanu VKM molekulām (Shakibaei M. Et al., 1997). Šis pārrāvums var ietekmēt matrices gēnu ekspresiju.
- Matricas komponentu atliekas var regulēt hondrocītu sintētisko funkciju. Integrēni spēj atpazīt ECM degradācijas produktus, tādējādi būtiski ietekmējot audu remontu pēc proteolītisku enzīmu iedarbības. T. Larssons un līdzautori (1989) ziņoja, ka nekaitīgu vai sadrumstalotu pro-theoglycans pievienošana šūnu kultūrai stimulē proteīnu un proteoglikānu sintēzi. Tomēr, augsts hialuronskābes izraisa ievērojama samazināšana iekļaušanu sulfāta, proteoglikānu sintēzi hondrocītos vistas embriju hondrocītu nobriedis cūkas un žurku chondrosarcoma šūnas. Turklāt, hialuronskābe - inhibitors, proteoglikānu atbrīvošana no šūnām pat klātbūtnē IL-LB, TNF-a, FGF, norādot, ka pirmais pretdarbojoties bioloģisko aktivitāti augšanas faktoriem un citokīniem. Precīzs mehānisms, kas pamato hialuronskābes darbību, paliek neskaidrs; Ir zināms, ka hondrocīti satur hialuronskābes receptoru, kas saistīts ar citolāzes aktīna šķiedrām. Hialuronskābes saistīšanās ar tā receptoru stimulē proteīnu fosforilēšanu. Tādējādi šie dati parāda hondrocītu metaboliskās funkcijas modulāciju ar sadrumstalotām vai dabīgām matrices proteīnu molekulām, aktivējot membrānas receptoru šūnas.
- Hronogrāfu ātras stimulācijas ar matricas olbaltumvielu sintēzi var izraisīt izmaiņas hondrocītu formā un / vai citoskeleta reorganizāciju.
- Daži citokīni (piemēram, IL-8) un augšanas faktori (piemēram, IGF-1, TGF-P) ir fiksēti ECM. Vislabāk zināms piemērs ir TGF-beta saistīšanās ar dekoreju, kas izraisa bijušās spējas samazināt šūnu augšanu olšūnu šūnās Ķīnas kāmiņā. Dati par to, ka skrimšļa dekorācijas saturs palielinās ar vecumu, liecina par TGF-beta bioloģiskās pieejamības samazināšanos novecošanas procesā. Augšanas faktorus un citokīnus kultūrā var atbrīvot no matricas atlikumiem un pēc tam modificēt hondrocīta funkciju.
[10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]
Hondrocītu monolaišā kultūra
Diferencēts fenotips hondrocītu galvenokārt raksturo sintēzi II tipa kolagēna un proteoglikānu, audu specifisku un zemu mitozes aktivitāti. Ir pierādījumi, ka ilgtermiņa audzēšanu šūnu vienslāņa, un pēc vairāku atkārtotiem fragmentiem šūnu, hondrocītus zaudē sfēriska forma, kļūt garenas, fibroblastu līdzīgu formu. Ar šādu fibroblastu metaplāzija sintētisks funkcija ir arī pārveidots šūnas, kas raksturīgs ar pakāpenisku samazināšanos sintēzē no collagens II, IX un XI veidi un uzlabota sintēze kolagēna I, III un Utipov. Mazie neagregati proteoglikāni tiek sintezēti ar funkcionālo agrerānu. Sinthezatepsīns B un L ir ļoti mazs diferencētās šūnās, bet diferenciācijas zuduma procesā palielinās. Kollagenâze-1 izsaka diferencētu hondrocītu ilgstošas kultivēšanas laikā tā izteiksme tiek samazināts tā palielinātai producēšanai audu inhibitors metalloproteâzes (TIMP).
Diferencētās hondrocītes atkārtoti izsaka diferenciētā fenotipa kolagēnu, ja tos pārnes no monolītās kultūras uz suspendētu. Diferenciācijas process, iespējams, ir saistīts ar šūnu formu. Šo īpašumu regulāri izmanto pētnieki, kuri pētījuši defektīvus transplantātus ar autologām hondrocītām. Nelielu skaitļu šūnu, kas iegūti no biopsijas materiāla, var reizināt ar mono slāņa kultūru un pēc tam ievietot vēlreiz trīsdimensiju matricā pirms transplantācijas. Re-izpausme konkrētu fenotipu dedifferentiated hondrocītu pārvietoti uz agarozes kultūrā, to var veicināt ar TGF-p-želatīns hidroksilapatīta kompleksa un askorbīnskābes.
Atbildot uz augšanas faktoru un citokīnu ietekmi, diferencēšanas procesā hondrocīti tiek modificēti. Šūnu atbildes reakcija uz citokīniem un augšanas faktoriem atšķiras starp nediferencētām un diferencētām hondrocītām. IL-1 stimulē fibroblastu proliferāciju, bet nediferencētu hondrocītu augšanu inhibē IL-1. DNS sintēzi stimulē IGF-1, iegarenās, bet ne saplacinātās hondrocītos. Diferencētās hondrocītēs IL-1β un TNF-α stimulējošais efekts procolagēzes produktos ir izteiktāks nekā nediferencētās.
Hondrocītu audzēšana
Hondrocītu audzēšana suspensijā šķidrā vidē vai dabīgā vai sintētiskā trīsdimensiju matricā stabilizē hondrocīta fenotipu. Šūnas saglabā savu sfērisko formu, sintezē audu specifiskos proteīnus. Jauna perikulārās matricas veidošanās pētījumam parasti ieteicama svērta hondrocīta kultūra. Hondrocītu kultūras sintētiskos vai dabīgos absorbējošos polimērus izmanto, lai implantētu šūnas skrimšļa defektos, lai stimulētu locītavu skrimšļa audu reģenerāciju. Sintētiskajai vai dabiskajai videi implantējamajās šūnās jāatbilst vairākām prasībām:
- Implantam ir jābūt porai konstruktīvai saķerei un šūnu augšanai,
- ne pats polimērs, ne tā degradācijas produkti nedrīkst izraisīt iekaisumu vai toksiskas reakcijas in vivo implantācijas laikā ,
- transplantāta nesēja spēja saistīties ar blakus esošo skrimšļu vai subhondrālo kaulu,
- dabiskajai vai sintētiskajai matricai jābūt spējīgai absorbēt, tā sadalīšanās ir jāsabalansē ar audu reģenerāciju,
- Lai atvieglotu skrimšļa labošanu, matricas ķīmiskajai struktūrai un matricas arhitektūrai būtu jāpalīdz saglabāt šūnu fenotipu, ko kodē hondrocīti, un sintezē audu specifiskos proteīnus,
- implantācijas laikā in vivo, ir jāizpēta sintētiskās vai dabīgās matricas mehāniskās īpašības.
[18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25]
Hondrocītu suspensija šķidrā fāzē
Cell stiprinājums uz plastmasas traukos, kur kultivēšana no hondrocītu var novērst to sienas pārklātas ar šķīdums metilcelulozes, agarozi, hidrogēls (poli-2-hydroxyethylmethacrylate) vai maisījumu kolagēna-agarozes. Saskaņā ar šiem nosacījumiem, veido klasterus un hondrocītu sintezēt pārsvarā darba audu specifisku aggrecan un kolagēns (II, IX, XI tipu). Parasti tiek atrasti divu veidu šūnas. Atrodas centrā šūnu patur sfēriska forma, ko ieskauj labi attīstītas ECM, ko apstiprināja histochemical un Ultrastrukturāli pētījumiem. Perifērijas hondrocītos ir diskuti kontūras, tās ieskauj reti ECM; Mazi ir zināms par šādu šūnu funkcionālajām īpašībām.
Suspensijā ir iespējama hondrocītu audzēšana mikrokanālos; Mikrokanālos izmanto dekstrāna pērles (citodekss), kolagēnu pārklājošas dekstrāna pērles (citodekss III), kolagēna I tipa kolagēna mikrosfēras. Šajos kultūrvides apstākļos hroms tiek piesaistīts mikrokanāla virsmai, saglabā to sfērisko formu un veido matrices līdzīgu materiālu. Turklāt kolagēna izmantošana veicina hondrocītu izplatīšanos un normālas fenotipa atkārtotu ekspresiju. Tādēļ hronkocītu audzēšanu kolagēna mikrosfērās var izmantot, lai atjaunotu šūnu fenotipu pirms transplantācijas.
Vēl viena metode hondrocītu suspensijas audzēšanai šķidrā vidē ir to kultivēšana blīvu lodiņu formā, kas sastāv no šūnām (0,5-1 * 10 b ), kas iegūta, centrifugējot. Šādas hondrocītes spēj radīt matricu, kurā ir liels daudzums proteoglikānu, II kolagēna, bet ne I tipa kolagēna, ko apstiprina histoloģiskās, imunohistochemiskās un kvantitatīvās metodes.
Hondrocītu suspensija dabiskajā ECM
Hondrocītus var kultivētās suspensijā ir trīsdimensiju matricas (soft agara, agarozi, zvanu gēni gel vai sūklis, hialuronskābe, fibrīna līme, algināts krelles).
Kultivētās agarozes hondrocītes saglabā savu normālo fenotipu un sintezē II kolagēnu un jaunākos agregātus par audiem. Kad kultivē agarozē, šūnu sintezētie proteoglikāni tiek izdalīti barotnē 50 dienas. Salīdzinājumam - monohonāta kultūrā jau pirmajās 5-6 audzēšanas dienās šūnas fāze ir pārpildīta ar glikozaminoglikāniem; kad audzē vidē pēc sintēzes un glikozamonoglikānu atbrīvošanas, pastiprina laika atkarīgais glikozaminoglikānu samazinājums pirmajās 8-10 dienās. Tomēr hondrocītu uzvedība to audzēšanas laikā agarozē atšķiras no tā, kas notiek in vivo apstākļos. Agarozē liels skaits sintezētu Aggregan agregātu satur mazākās un mazākās molekulas nekā in vivo. TGF-P stimulē proteoglikānu sintēzi ekspertē, bet samazina agrerka sintēzi agarozē.
Algināts ir lineārs polisaharīds, kas iegūts no brūno jūraszālēm. Divvalentu katijonu, piemēram, Ca 2+ jonu klātbūtnē , šis polimērs kļūst par gēlu. Katrs hondrocītu nozvejotas algināts ieskauj matricu negatīvi lādētu polisaharīdu, poras, kas ir salīdzināmi ar tiem, caurspīdīgs skrimšļiem. Matrica kas veidojas hondrocītus in algināta krelles, kas sastāv no diviem segmentiem - kārtiņu ar šūnu saistīto matricu, kas atbilst pericellular un teritoriālo matrices locītavu skrimšļu un pilnu tālvadības matricas starpteritoriju ekvivalentu native audos. 30.dienā kultūras, relatīvā un absolūtā apjoma aizņem šūnas, un katrs no diviem departamentiem algināts lodītes ir gandrīz pilnībā identiski tiem dzimtās skrimšļiem. Gandrīz 30 dienām hondrocītus saglabā savu sfēriska forma un ražot aggrecan, hidrodinamisko īpašībām, kas ir līdzīgas aggrecan molekulu matricas locītavu skrimšļu un kolagēna molekulas, II, IX un XI tipiem. Tajā pašā laikā, piemēram, citām kultūrām, apturēšanu, algināts pērlītes uz virsmas saplacinātu šūnu ir klāt, kas rada nelielu daudzumu I tipa kolagēna molekulas, atbrīvo tieši vidē, un kas nav iekļauti VCR. Algināta pērlītēs tiek novērota mērena hondrocītu proliferācija. Pēc 8 mēnešu audzēšanai algināts gēla nobriedušu hondrocītu nezaudē vielmaiņas aktivitāti un turpina sintezēt audu specifisku kolagēna II tipa un aggrecan.
N. Tanaka un viņa līdzautori (1984) pētīja dažādu dabiskās molekulu difūzijas īpašības alginātajā un konstatēja, ka molekulas, kas ir lielākas par 70 kD, neizkliedējas ar alginātu. Tādējādi oligēnu šūnu kultivēšana ir piemērota, lai pētītu matricas biosintēzes un ECM organizācijas regulējumu. Algināta kultivēto šūnu pieejamība ļauj pētīt peptīdu regulējošo faktoru un farmakoloģisko līdzekļu ietekmi uz transkripcijas, posttranskripcijas un translācijas līmeni.
Hondrocītus audzē arī kolagēna šķiedru matricā I un II. S. Nehrer un līdzautori (1997) salīdzināja suņu hondrocītu darbību porainās kolagēna-proteoglikanā polimērās matricās, kas satur dažāda veida kolagēnus. Viņi konstatēja būtiskas atšķirības hondrocītu biosintētiskās funkcijas morfoloģijā, kas tika kultivēti kolagēna matrīcēs, kas satur I un II veidu kolagēnu. II kolagēna matricas šūnas salieza savu sfērisko formu, savukārt I tipa kolagēna formā tiem bija fibroblastam līdzīga morfoloģija. Turklāt II tipa kolagēna matricā hondrocīti ražoja vairāk glikozaminoģiklānu. J. Van Susante et al (1995) salīdzināja algoritmu un kolagēna (I tipa) gelu kultivēto hondrocītu īpašības. Autori konstatēja ievērojamu pieaugumu skaita šūnu kolagēna gēlu, bet 6. Diena audzēšanu, šūnas zaudēja savu raksturīgo fenotipu, pārvērtās fibroblastam līdzīga šūnām. Algināta gēlā tika novērota šūnu skaita samazināšanās, bet hondrocīti saglabāja normālu fenotipu. Ar kolagēna gēla proteoglikānu vienu šūnu daudzums bija ievērojami lielāks nekā algināts, bet samazinājums bija vērojams gel matrix elementu sintēzi, sākot no 6 dienas audzēšanu, savukārt algināta sintēzes turpināja augt.
Cieta trīsdimensiju fibrīna matrica ir dabiska viela, kas atbalsta tajā nosvērtās hondrocītus diferencētā fenotipā. 3D fibrīna matricu var izmantot arī kā līdzekli hondrocītu transplantācijai. Fibrīna priekšrocības ir citotoksicitātes trūkums, spēja aizpildīt telpu, adhezīvās spējas. By histoloģiskās un bioķīmiskos pētījumos Autoren-diografii, elektronu mikroskopijas atklājās, ka hondrocītus kas ir fibrīna želejas saglabā savu morfoloģijas, vairoties un ražot matricu pat pēc 2 nedēļām audzēšanu. Tomēr G. Homminga et al (1993) ziņo, ka pēc 3 dienām kultūras, sākas sabrukumu fibrīna gaitā dedifferentiation no hondrocītu.
Hondrocītu suspensija mākslīgā (sintētiskā) ECM
Skeleta implantus rekonstruktīvai vai ortopēdiskai ķirurģijai var iegūt, izaudzējot izolētas hondrocītus in vitro sintētiskā bioloģiski saderīgā matricā.
Kultivētās poliglikolskābes hondrocītes proliferē un saglabā normālu morfoloģiju un fenotipu 8 nedēļu laikā. Hondrocīta poliglikolskābes komplekss sastāv no šūnām, glikozamonoglikaniem, kolagēniem un ārējās kolagēna kapsulas. Tomēr šādos implantos ir divu veidu kolagēna molekulas - I un II. Implantus, kas dediferencēti ar virkni hondrocītu fragmenti, ir lielāks glikozamonoglikānu un kolagēnu skaits nekā implantātos galvenokārt no nediferencētām hondrocītām.
L. Freed et al (1 993b), salīdzinot uzvedību hondrocītu kultūru kā cilvēka un liellopu in šķiedraina poliglikolskābes (EQAP) un in nesaskaņa polilaktilovoy acid (PPLC). Pēc HSVG vai PPLC buļļu hondrocītu audzēšanas 6-8 nedēļām autori novēroja šūnu proliferāciju un skrimšļu matricas reģenerāciju. HSBC hondrocīti bija sfēriski, kas atrodas lakūnēs, ko ieskauj kramtveida matrica. Pēc 8 nedēļu ilgas in vitro kultūras reăenerētie audi saturēja līdz 50% sausnas (4% šūnu masas, 15% glikozamino glikānu un 31% kolagēna). PPLK šūnās bija vārpstveida formas, neliels daudzums glikozaminoglikānu un kolagēna. HSBC šūnu augšana bija 2 reizes intensīvāka nekā PTCA. In vivo apstākļos HPVC un PPLC audzēti hondrocīti uz 1 līdz 6 mēnešiem radīja audus, kas histoloģiski līdzīgi skrimšļiem. Implanti satur glikozamonoglikanus, I un II tipa kolagēnus.
Augļa buļļu hondrocītus kultivē porainā augsta blīvuma hidrofobā un hidrofilā polietilēnā. Pēc 7 dienu inkubācijas abos substrātos šūnas saglabāja sfērisku formu, kas galvenokārt satur II tipa kolagēnu. Pēc 21 audzēšanas dienām izrādījās, ka hidrofilajā matricā ir vairāk II tipa kolagēna nekā hidrofobā matrica.
Skrimšļa audus var iegūt arī, kultivējot monolīšos uz Millicell-CM filtriem. Filtra iepriekšpārklājums ar kolagēnu ir nepieciešams hondroītu piestiprināšanai. Histoloģiska kultūras pārbaude parāda hondrocītu uzkrāšanos ECM, kas satur proteoglikanus un II tipa kolagēnu. I tipa kolagēna šādā kultūrā nav konstatēta. Hondrocitos iegūtajos skrimšļa audos ir sfēriska forma, bet audu virspusē tie ir nedaudz saplacināti. Jaunizveidoto audu biezums laika gaitā palielinājās un bija atkarīgs no šūnu monolīzes sākotnējā blīvuma. Optimālos kultivēšanas apstākļos kristāņu audu biezums sasniedz 110 μm, tā šūnu un kolagēna organizācija virsmā un dziļajos slāņos ir līdzīga locītavu skrimšļa veidošanās procesam. VKM satur apmēram 3 reizes vairāk kolagēna un proteoglikānu. Pēc 2 nedēļām audzēšanas tika konstatēta matrices-sa uzkrāšanās, kas ļāva audus noņemt no filtra un izmantot to transplantācijai.
Sims et al. (1996) pētīja hondrocītu audzēšanu polietilēna oksīda gelā iekapsulētā polimēra matricā, kas ļauj lielu šūnu skaitu transportēt ar injekciju. Pēc sešām nedēļām pēc injekcijas zemādas audos, kas bija atēnu pelēm, tika izveidots jauns skrimslis, kuru morfoloģiski raksturo balta opalescence, kas līdzīga hialīna skrimšlim. Histoloģisko un bioķīmisko pētījumu dati liecina par aktīvi proliferējošu hondrocītu klātbūtni, kas rada ECM.
Paskaidrojums
Ķirurģisko audu pārbaude tiek izmantota, lai izpētītu ana un katabolismu tajā, homeostāzijā, rezorbciju un remontu. Handrogēni kramtveida audu pētījumos atbalsta normālu fenomenu un ECM sastāvu, kas ir līdzīgs tiem, kuri ir in-vivo locītavu skrimšņos . Pēc 5 dienu audzēšanas seruma klātbūtnē tiek sasniegts pastāvīgs sintēzes un dabiskās degradācijas līmenis. Resorbcija var paātrināt audu kultūru un galvenajā kultūrā ar papildus serumu, izmantojot vairākus aģentus, piemēram, IL-IB, TNF-a, bakterialnyhlipopolisaharidov, atvasinājumi retīnskābi vai aktīvo skābekļa radikāļu. Lai izpētītu savu remonta skrimšļu bojājumu tiek izraisītas ar šķīstošo iekaisuma mediatoru (H 2 O 2, IL-1, TNF-a) vai fiziskās plīsumu matricas.
Organotīpisko kultūru metode ir modelis izolētu ārējo faktoru in vitro izpētei uz hondrocīta un apkārtējās matricas. In vivo hondrocīti reti atrodami ECM un nesaskaras viens ar otru. Eksplantāta locītavu skrimšļa kultūra saglabā šo strukturālo organizāciju, kā arī īpašo mijiedarbību starp hondrocītām un to apkārtējo ārpusšūnu vidi. Šo modeli izmanto arī, lai pētītu mehāniskā stresa, farmakoloģisko līdzekļu, augšanas faktoru, citokīnu, hormonu ietekmi uz skrimšļa metabolismu.
Vēl viena krisšveida audu izskaidrojuma priekšrocība ir hondrocīta bojājuma trūkums ar proteolītisku fermentu vai mehānisku faktoru, kas ir neizbēgams, izolējot šūnas. Receptori un citi membrānas proteīni un glikoproteīni ir aizsargāti no postošiem faktoriem.
Hondronu kultūra
Hondron - strukturālo, funkcionālo un vielmaiņas locītavu skrimšļu vienība, kas sastāv no hondrocītu pericellular matricas un tās kompaktā pavedienu kapsulā un ir atbildīga par homeostāzes matrices. Hondrony mehāniski iegūtas no skrimšļiem un apkopoti, izmantojot vairākas kārtas maza ātruma homogenizācijas. Izolēti no zonām dažādu dziļumos hondrony skrimslis var iedalīt četrās kategorijās: viena hondron, dvīņu hondrony, vairākas (trīs vai vairāk), lineāri sakārtots hondrony (kolonna hondronov) hondronov sastrēgumu.
Vieni hrontieri parasti ir atrodami neskartu skrimšļu vidū slāņos, pāri - vidējā un dziļo slāņu robežās, lineāri izvietoti vairāki hrontiņi ir raksturīgi dziļam skrimšļa slānim. Visbeidzot, hondrūnu kopas sastāv no nejauši izvēlētām vienotu un pāru hondru grupām, kas pēc homogenizācijas saglabā agregēto stāvokli. Hondruma uzkrāšanās ir lieli skrimšļu fragmenti, kas parasti satur vairākus hondrus un radiāli izvietotus kolagēnas fibrilus, ti, tipisku organizāciju, kas raksturīga matricas dziļajām slāņām. Hondrons tiek imobilizēts caurspīdīgā agarozē, kas ļauj pētīt to struktūru, molekulāro sastāvu un vielmaiņas aktivitāti. Hondrona - agarozes sistēma tiek uzskatīta par skrimšļa mikromodeli, kas atšķiras no tradicionālās hondrocīta - agarozes sistēmas, jo tiek saglabāta dabiskā mikropavedība, nav nepieciešams to sintēze un montāža. Hondronu kultūra ir paraugs šūnu un matricas mijiedarbības pētījumam locītavā skrimšļa gadījumā normālos un patoloģiskos apstākļos.
[31], [32], [33], [34], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41]
Nemirstīgu hondrocītu kultūra
Lai izveidotu pastāvīgas šūnu līnijas, izmanto rekombinanto DNS vai onkogēnu saturošus vīrusus, kas var padarīt šūnu "nemirstīgu". Nemirstīgās hondrocītes spēj bezgalīgu proliferāciju, saglabājot stabilu fenotipu. F. Mallein-Gerin et al (1995) parādīja, ka onkogēna ir SV40T izraisīta proliferācija peles hondrocītu kas tādējādi turpina stabili izteikšanai collagens II, IX un XI veidu, kā arī locītavu un aggrecan saistošais proteīns. Tomēr šāda šūnu līnija iegūst spēju sintezēt I tipa kolagēnu, ja to kultivē monohidrāklā vai agarozes gelā.
W. Hortons un līdzautori (1988) aprakstīja nemirstīgu šūnu līniju ar zemu II tipa kolagēna mRNS ekspresijas pakāpi. Šīs šūnas iegūtas, pārveidojot tās ar peles retrovīrusu, kas satur I-myc- un y-ra-onkogenus. Šāda veida šūnas ir unikāls modelis, kas ļauj izpētīt artēriju matricas mijiedarbību, ja nav II tipa kolagēna, kā arī regulē II tipa kolagēna sintēzi.
Hondropitov kultūra ar mutācijas vai dzēst gēnu - ērts modelis pētījumu fizioloģisko funkciju. Šis modelis ir īpaši piemērots pētot lomu specifisku molekulu skrimšļa matrices organizācijās vai pētot ietekmi dažādu normatīvo faktoru uz skrimšļa metabolismu. Hondrocītus remote gēnu sintezēts kolagēna tipa IX kolagēna šķiedrās platāka nekā parasti, kas norāda, ka kolagēns tips IX regulē diametru šķiedru. Kā es minēts 1. Nodaļā, tikko bija II gēnu mutāciju COLAI kodējuma veidu kolagēna ģimenēm ar primāro vispārējo osteoartrītu. Lai izpētītu šo efektu mutanta kolagēna II tipa locītavu matricā R. Dharmrvaram et al (1997) veic transfekcijas ( "piesārņojumu" ārzemju nukleīnskābes) defektīvs COL 2 AI (arginīna pozīcijā 519 ir aizstāts ar cisteīnu) cilvēka augļa hondrocītu in vitro.
Kokkultuāru sistēma. Kopā krekls mijiedarbojas ar citu tipu šūnām, kas atrodas sinoviālajā membrānā, sinovialā šķidrumā, saitēs, subhondrālo kaulos. Hondrocītu metabolismu var ietekmēt dažādi šūnu sintezētie šķīstošie faktori. Tātad, artrīta locītavu skrimsli iznīcina proteolītiskie fermenti un brīvajiem radikāļiem, kurus ražo sinoviālās šūnas. Tādēļ modeļi ir izstrādāti, lai pētītu kompleksu mijiedarbību starp skrimšļiem un apkārtējiem audiem, kurus sauc par kultūru.
S. Lacombe-Gleise et al (1995) bija kultivētas trušu hondrocītus un osteoblastus, kas coculture sistēmā (COSTAR), kurā šūnas tika atdalītas mikroporu membrānu (0.4 micron) ļauj apmaiņu starp abām šūnu tipiem, bez tieša kontakta. Šis pētījums parādīja osteoblastu spēju stimulēt hondrocītu augšanu šķīstošo mediatoru vidū.
A.M. Malfaitē un līdzautori (1994) pētīja attiecības starp perifēro asiņu monocītām un hondrocītām. Šis modelis ir ērts, lai pētītu procesus, kurus mediē citokīni, iekaisuma arttropījumos (reimatoīdais artrīts, seronegatīvs spondilīts uc). Modeļa autori atdalīja šūnas ar olbaltumvielu saistošo membrānu ar porām ar diametru 0.4 μm. Pētījumā konstatēts, ka lipopolysaccharide stimulētas monocytes izstrādāts iFNO IL-1-A, kas inhibē hondrocītu aggrecan un veicinājis degradāciju jau sintezēto aggrecan pildvielu.
K. Tada et al (1994), kas izveidota ar coculture modeli, kurā endotēlija šūnas kolagēnu (I tips) gel tika ievietotas iekšējā kamerā no ārējā kamerā hondrocītos novietoti filtru ar poru izmēru no 0,4 mikroniem atdalīta no tā. Visā izolācijā no ārējās kameras stāvokļa cilvēka endotēlija šūnas veidoja caurules kolagēna želejā EGF vai TGF-a klātbūtnē. Abu TGF šūnu vienlaikus audzējot, endotēlija šūnu atkarīgā forma tika nomākta. Šī procesa hondrocītu inhibīcija daļēji tika izvadīta ar anti-TGF-beta antivielām. Var pieņemt, ka HGF-beta, ko ražo hondrocīti, nomāc pats pašu skrimšļa vaskulāri.
S. Groots un līdzautori (1994) vienlaikus kultivēja hondrocītus no 16 dienu vecas augļa peles ar smadzeņu audu gabaliem hipertrofijas un proliferācijas zonām. Pēc četrām kultūras dienām tika novērota hondrocītu transdifenentiācija osteoblastos un osteoīdu veidošanās sākums. Pēc 11 audzēšanas dienām skrimšļa daļa tika aizstāta ar kaulu audiem, un kaulu matrica tika daļēji kalcificēta. Daži neiropeptīdi un neirotransmiteri, ko ražo smadzeņu audi, ietekmē osteoblastu metabolismu vai uz tiem ir receptori. Starp tiem var izdalīt norepinefrīnu, vazaktīvo zarnu peptīdu, peptīdu, kas saistīts ar kalcitonīna gēnu, vielu P un somatostatīnu. Kultivēti ar hondrocītām, smadzeņu audu gabali var radīt dažus no šiem faktoriem, kas var izraisīt hondrocītu transdifenentiācijas procesu osteoblastos.
[42], [43], [44], [45], [46], [47], [48], [49]
Ārējo faktoru ietekme uz hondrocītu kultūru
Skābekļa spriedzes ietekme uz hondrocītu vielmaiņu
Vairumā gadījumu hondrocītu kultūras attīstās atmosfēras skābekļa spriedzes apstākļos. Tomēr ir labi zināms, ka in vivo hondrocīti eksistē zem hipoksiskiem apstākļiem, un skābekļa spriedze atšķiras ar dažādiem patoloģiskiem apstākļiem. Gatavošanas laikā tiek novērotas būtiskas izmaiņas epifizu asins piegādē. Tā kā vaskulārizācija dažādās augšanas plāksnes vietās atšķiras, arī skābekļa spiediens ir atšķirīgs. C. Brighton un R. Heppenstall (1971) parādīja, ka trušu kaudzē trušās trušiem slimības skābekļa spiediens hipertrofiskajā zonā ir mazāks nekā apkārtējā skrimsā. Dažu metabolisko parametru mērījumi ir parādījuši, ka hondrocīti spēj ātri reaģēt uz vietējām skābekļa koncentrācijas izmaiņām. Pirmkārt, ar zemu skābekļa spriedzi samazinās hondrocītu patēriņš. Ar skābekļa spriedzes samazināšanos no 21 līdz 0,04%, tiek palielināta glikozes izmantošana, palielināta glikolīzes fermentu aktivitāte un pienskābes sintēze. Pat ar zemu skābekļa spriedzi absolūtais ATP, ADP un AMP daudzums saglabājas stabils. Šie dati norāda hondrocītu metabolisma virzību, lai maksimizētu enerģijas saglabāšanu. Tomēr sintētiskā aktivitāte un līdz ar to arī reparācijas procesi mainās hipoksijas apstākļos.
Augsts skābekļa spriedze ietekmē arī hondrocītu metabolismu, izraisot proteoglikānu un DNS sintēzes samazināšanos, skrimšļa matricas noārdīšanos. Parasti šīs sekas rada brīvo skābekļa radikāļu veidošanos.
Jonu koncentrācijas un vides osmotiskā spiediena ietekme uz hondrocītu funkciju
In native skrimslis jonu koncentrācijas ir būtiski atšķirīgs no citu audu: nātrija saturs ekstracelulāro nesēja ir 250 - 350 mmoles, un tās osmolaritāte - 350-450 mOsm. Kad izolēt hondrocītus no videomagnetofonu un inkubēt tos standarta medijos (DMEM (Barotne Dulbecco s Minimālais Essential Medium - Barotne Dulbecco minimālā Essential vidēja) osmotiskais - 250-280,7 mOsm) mainās strauji apkārtējo vidi šūnā. Turklāt, koncentrācija kalcija un kālija standarta mediju ir ievērojami zemāks nekā native audu A anjonu koncentrācija - ir ievērojami lielāks.
Pievienojot saharozi vidēja noved pie palielināt tās osmolaritāti un inducē pārejošu koncentrācijas palielināšanos intracelulārās H + un anjoniem no kalcija citosolā. Šādas intracelulāras izmaiņas var ietekmēt hondrocītu diferenciācijas procesus un to metabolisko aktivitāti. J. Urban et al (1993) konstatēts, ka iekļaušana 35 8-sulfāta un 3 H-prolīns izolētiem hondrocītu inkubējot DMEM standarta vidē 2-4 stundas, bija tikai 10% no līmeņa native audos. Synthesis intensitāte sasniedza kad osmolaritāte ārpusšūnu nesēja 350-400 mOsm in nesen izolētām hondrocītu un skrimšļu explants in. Turklāt hondrocīta apjoms palielinājās par 30-40% pēc izdalīto šūnu ievietošanas standarta DMEM vidē ar minēto osmolaritāti. Tomēr, kad kultivētās hondrocītus saskaņā non-fizioloģisko osmolaritāte uz 12-16 stundām, šūnas, kas pielāgoti jaunajai videi, samazinot intensitāti bīdes ir proporcionāls biosintēze osmolaritāte ārpusšūnu vidē.
P. Borgetti et al (1995) pētīja efektu osmolaritāte no ārpusšūnu nesējā augšanas, morfoloģijas un biosintēzes cūku hondrocītu. Autori demonstrēja līdzīgas bioķīmiskās un morfoloģiskās pazīmes hondrocītu kultivētās mediju ar osmolaritāti mOsm 0,28 un 0,38. Kad 0.48 mOsm osmolaritāte vidējā pirmo 4-6 stundu kultūras laikā tika novērota samazināšanās šūnu proliferācija un proteīnu sintēzi, bet pēc tam radās atjaunot šos parametrus, kas galu galā sasniegts kontroles vērtības. Kad kultivēšanas hondrocītus tādā vidē ar 0,58 mOsm osmotiskais šūnas zaudē spēju atbalstīt fizioloģiskā intensitātes proliferatīvu procesus un pēc 6 dienām skaits hondrocītu ir ievērojami samazināts. Kad 0.58 mOsm osmolaritāte vidēja tika novērota dziļu inhibīciju proteīnu sintēzi. Bez tam, kad kultivētas nesēju ar osmolaritāti mOsm 0,28-0,38 hondrocītus saglabā fizioloģiska fenotipa pie augstāka osmolaritāte (mOsm 0,48-0,58) būtiskas izmaiņas šūnu morfoloģijā, kā to izteikti zudums raksturīgs fenotips hondrocītus konversiju in fibroblastam līdzīga šūnām, un šūnu spēju montāžu matricas proteoglikānu zudumu. Šā pētījuma rezultāti liecina, hondrocītu reaģēt uz svārstībām ierobežoto osmozi ekstracelulāro vidi.
Citu jonu koncentrācijas izmaiņas var ietekmēt hondrocītu biosintēzes procesus. Tādējādi 35 S (sulfāta) iekļaušanas pakāpe palielinās par pusi, palielinoties kālija jonu koncentrācijai no 5 mmol (koncentrācija standarta DM DM vidē) līdz 10 mmol (koncentrācija VKM in vivo). Kalcija koncentrācija zem 0,5 mmol veicināja kolagēna ražošanu ar nobriedušu buļļu hondrocītu, bet koncentrācija 1-2 mmol (kas atbilst DM DM standarta vidējai koncentrācijai) izraisīja ievērojamu kolagēna sintēzes samazināšanos. Liels kalcija līmenis (2-10 mmol) tika novērots mērenā biosintēzes līmeņa palielināšanās. Hondrocītu pievienošana VKM proteīniem piedalās dažādos katijonos. Tādējādi magnija un mangāna joni nodrošina piestiprinājumu fibronektīnam un II kolagēna veidam, savukārt kalcija joni nepiedalās hondrocītu piestiprināšanā proteīniem. Tādējādi aprakstīto pētījumu rezultāti norāda uz izmaiņām vidē esošo kālija, nātrija, kalcija un vidē esošo kālija jonu jonu uz hondrocītu biosintēzes funkcijas, kas inkubētas standartmetodos.
Mehāniskā stresa ietekme uz hondrocītu metabolismu
Kaklasa imobilizācija izraisa muguras atforošanos pret skrimšļiem, kas norāda uz nepieciešamību pēc mehāniskiem stimuliem normālam metabolisma procesam ECM. Vairumā gadījumu izmantotie šūnu kultūru modeļi pastāv normālā atmosfēras spiediena apstākļos. M. Wright un līdzautori (1996) parādīja, ka mehāniskā vide ietekmē hondrocītu metabolismu, šūnu reakcija ir atkarīga no kompresijas slodzes intensitātes un biežuma. Eksperimenti ar slodzi uz neskarts explants par locītavu skrimšļa in vitro demonstrēja samazinājumu sintēzi olbaltumvielu un proteoglikānu zem statiskās slodzes, dinamiskā slodze savukārt stimulētu šos procesus. Precīzi mehānismi mehānisko slodzes ietekmi uz skrimšļa kompleksa īstenošanu, un, iespējams, saistīts ar celmu šūnas, hidrostatisko spiedienu, osmotisko spiedienu, elektrisko potenciālu un šūnu virsmas receptoriem matricas molekulām. Lai izpētītu katra šī parametra efektu, ir jāizveido sistēma, kurā viens parametrs var būt neatkarīgi mainīgs. Piemēram, eksperimenta kultūra nav piemērota šūnu deformācijas pētīšanai, bet to var izmantot, lai pētītu spiediena kopējo ietekmi uz hondrocītu metabolisko aktivitāti. Compression skrimšļa noved pie šūnu deformācijas, un arī kopā ar rašanos hidrostatiskā spiediena gradienta, elektrisko potenciālu, un šķidruma plūsmas maiņas fizikālo un tādus faktorus kā ūdens saturu matricā, blīvumu elektriskais lādiņš, līmeni osmotisko spiedienu. Šūnu deformāciju var pētīt, izmantojot izolētas hondrocītus, kas iegremdētas agarozes vai kolagēna želejā.
Ir izstrādātas vairākas sistēmas, lai pētītu mehāniskās stimulācijas ietekmi uz hondrocītu kultūru. Daži pētnieki šajā nolūkā izmanto sistēmas, kurās spiediens tiek piemērots šūnu kultūrai caur gāzu fāzi. Piemēram, JP Veldhuijzen et al (1979), izmantojot spiedienu, kas ir augstāks par atmosfēras 13 kPa pie zemas frekvences (0,3 Hz) 15 minūšu laikā, novērota in cAMP sintēzi un proteoglikānu un nolaišanas DNS sintēzi pieaugumu. R. Smith et al (1996) parādīja, ka periodiskā ekspozīcija primāro kultūru hondrocītus vēršu hidrostatisko spiedienu (10 MPa) pie 1 Hz 4 stundām izraisīja pieaugumu sintēzē aggrecan un kolagēna tipa II, tā kā konstants spiediens neietekmēja šajos procesos. Izmantojot līdzīgu sistēmu M. Wright et al (1996) ziņo, ka cikliskais spiediens uz šūnu kultūrā ir saistīta ar hyperpolarization no šūnu membrānas hondrocītu un aktivizēšanas Ca 2+ -dependent kālija kanālus. Tādējādi cikliskā spiediena ietekme ir saistīta ar jonu kanāliem, kas tiek aktivizēti izstiepjot, hondrocīta membrānā. Hondrocītu reakcija uz hidrostatisko spiedienu ir atkarīga no šūnu kultūras apstākļiem un pielietotās slodzes biežuma. Tādējādi, ciklisks hidrostatiskā spiediena (5 MPa) samazina iekļaušanu sulfāta ekspluatācijā hondrocītu vienslāņa ar frekvenci 0,05, 0,25 un 0,5 Hz, bet par frekvenci, kas lielāka par 0,5 Hz iekļaušanas sulfāta skrimšļa explant palielinās.
M. Bushmann et al. (1992) ziņoja, ka handrocīdi agarozes gēlā maina biosintēzi, reaģējot uz statisko un dinamisko mehānisko slodzi, tāpat kā kultivētu neskartu orgānu. Autori konstatēja, ka mehāniskā slodze rada hiperosmotisku stimulu, kam seko pH samazināšanās hondrocītos.
Mehāniskās izstiepšanas efektu var izpētīt uz gelu iegremdēto šūnu kultūru. Izstiepšanas spēku var izveidot, izmantojot datora vadītu vakuumu. Ja sistēma ir zināmā mērā vakuumā, Petri trauka grunts ar šūnu kultūru tiek pagarināts par noteiktu daudzumu, deformācija ir maksimāla krūzes dibena malām un ir minimāla centrā. Izstiepšanās tiek pārnesta un kultivēta hondrocītu Petri trauciņā. Izmantojot šo metodi, Holm-Vall un līdzautori (1995) ir pierādījuši, ka kultivēta kolagēna (II tipa) gēla hondrosarkomas šūnas palielina α 2 -integrīna mRNA ekspresiju . 2 p r integrīna ir spējīgs saistīties ar kolagēna II tipa. To uzskata par mehānoreceptoru, jo tas mijiedarbojas ar aktīniem saistošiem proteīniem, tādējādi savienojot ECM un citoslēgu.
PH ietekme uz hondrocītu metabolismu
ECT intersticiālā šķidruma pH ir vairāk skābens nekā citos audos. A. Maroudas (1980) noteica locītavu skrimšļa pH 6,9. W. Diamant un līdzautori (1966) atraduši pH 5,5 patoloģiskos apstākļos. Ir zināms, ka hondrocīti dzīvo ar zemu PO2, kas norāda uz glikolīzes (95% no kopējā glikozes metabolīta) nozīmīgo lomu šo šūnu vielmaiņas procesā; glikolīzi papildina liela pienskābes daudzuma ražošana.
Papildus vides paskābināšanai ar glikolīzes produktiem, pašiem matricas komponentiem ir liela nozīme. Liels skaits fiksētā negatīvu maksas uz ārpusšūnu proteoglikānu maina jonu sastāvs: tur ir augsta koncentrācija brīvo katjonu (piemēram, H +, Na +, K + ), un koncentrācija ir zema anjonus (piemēram, O2, NPHS). Turklāt mehāniskās slodzes ietekmē no ECM tiek izmests ūdens, kas noved pie fiksēto negatīvo elektrisko piesārņotāju koncentrācijas palielināšanās un katijonu piesaistes matricai. Tas ir saistīts ar ekstracelulārās vides pH samazināšanos, kas ietekmē intracelulāro pH līmeni, tādējādi mainot hondrocītu metabolismu. R. Wilkin un A. Hall (1995) pētīja ekstracelulārās un intracelulārās vides pH ietekmi uz matricas biosintēzi, izmantojot izolētas buljona hondrocītus. Viņi novēroja dubultu matricas sintēzes modifikāciju ar pH samazināšanos. Nedaudz samazinājusies pH (7.4
[50], [51], [52], [53], [54], [55], [56], [57]
Hondrocītu metabolisma kultivēšanas līdzekļa sastāva ietekme
Hondrocītu kultivēšanai paredzētais līdzeklis jāatbilst eksperimentālajiem apstākļiem. Pēdējos gados, lai optimizētu kultūras apstākļus, ir izmantots teļa serums. Tomēr, lietojot serumu, jāapsver vairāki svarīgi punkti:
- ārējā audu perifērijas šūnu augšana orgānu kultūrās,
- dažādu sēriju seruma sastāvu mainīgumu,
- nezināmu sastāvdaļu klātbūtne tajos,
- palielināts interferencijas risks, artefakti, pētot dažādu bioloģisko faktoru ietekmi uz šūnu vielmaiņas aktivitāti.
Pēdējā piemērs ir pētījums par EGF ietekmi uz skrimšļu hondrocītām žurkām. EGF stimulēja 3 H-timidīna pievienošanu un DNS satura palielināšanos kultūrā. Šis efekts bija izteiktāks ar zemu koncentrāciju serumā (<1%), bet lielā koncentrācijā (> 7,5%) efekts pazuda.
Ir labi zināms, ka sintēzes un degradācijas līmeņi DMEM, kas bagātināti ar teļa serumu, ir ievērojami palielinājušies salīdzinājumā ar in vivo apstākļiem. Atšķirības starp in vivo un metabolismu in vitro var būt saistītas ar atšķirībām starp sinoviālo šķidrumu un vidi, kurā šūnas tiek kultivētas. D. Lee et al. (1997) kultivēja jaunos buļļu hondrocītus agarozē, izmantojot uzturvielu barotni, kas satur DMEM, kas bagātināts ar 20% teļu serumu, un lielu daudzumu parasto alogēno sinoviālā šķidruma. Sinovilā šķidruma klātbūtne vidē izraisīja proteoglikānu skaita palielināšanos līdz 80% no kopējā sinoviālā šķidruma daudzuma. Iegūtie rezultāti liecina, ka kultūrās esošais sinoviālais šķidrums inducē metabolisko ātrumu, kas ir līdzīgs kā in vivo, ar augstu glikozamonoglikānu sintēzi un zemu šūnu dalījuma līmeni.
G. VERBRUGGEN et al (1995) parādīja, ka sintēze no 35 S-arrpeKaHa cilvēka hondrocītus kultivētas in agarozi DMEM bez serumā bija 20-30% no līmeņa sintēzes novērota DMEM, kam pievienots 10% teļa serumu. Autori noteikt, cik lielā mērā IGF-1, IGF-2, TGF-P vai samazinātās insulīna ražošanas aggrecan barotnē bez serumā. Autori secina, ka 100 ng / ml insulīna, IGF-1, vai IGF-2 daļēji sintēzes samazināšanos aggrecan līdz 39-53% no kontroles līmeņiem. Ar šo faktoru kombināciju nav konstatēta sinerģiska vai kumulatīva parādība. Tajā pašā laikā, 10 ng / ml of TGF-P klātbūtnē 100 ng / ml insulīna stimulē sintēzi aggrecan līdz 90% vai vairāk no atskaites līmeni. Visbeidzot, transferīns serumā, atsevišķi vai kombinācijā ar insulīnu, neietekmē agrerkāna sintēzi. Kad teļu serums tika aizstāts ar liellopu seruma albumīnu, kopējais agrerka saturs bija ievērojami samazināts. Enrichment barotne ar insulīnu, IGF, vai TGF-P ir daļēji atjaunota šūnu spēju ražot aggrecan pildvielas. Šajā gadījumā IGF-1 un insulīns spēj saglabāt homeostāzi šūnu kultūrās. Pēc 40 dienām kultūras barotnē, kam pievienots 10-20 ng / ml IGF-1, proteoglikānu sintēze tika uzturēta tajā pašā līmenī vai pat augstāka salīdzinājumā ar vidi, kas satur 20% teļa serumu. Katabolisma procesi noritēja lēni barotnē papildināts ar IGF-1, nekā vidējā papildināts ar 0,1% albumīna šķīdums, bet nedaudz ātrāk barotnē, kam pievienots 20% serumu. Ilgstošās kultūrās 20 ng / ml IGF-1 saglabā stabilu šūnu stāvokli.
D. Lee et al (1993), salīdzinot efektu sastāva barotnē (DMEM, DMEM + 20% calf seram, DMEM + 20 ng / ml IGF-1) par DNS sintēzes kultūrā explant skrimšļa, vienslāņa kultūrā un suspensijā agarozes . Kad kultivētas Agarozes klātbūtnē seruma autoru novērota tendence grupēt hondrocītu lielās koncentrācijās. Šūnas kultivētās bez seruma un IGF1, saglabā apļveida formu agarozes, tika savākti nelielās grupās, taču neveido lielus agregātus. In vienslāņa DNS sintēze bija ievērojami lielāks barotnē seruma saturošas nekā vidējā papildināts ar IGF-1; DNS sintēze pēdējā bija daudz lielāka nekā neapgrūtinātā vidē. Kad kultivēšanu hondrocītus veidā suspensijas agarozi nekoncentrēts barotnē un barotnē ar IGF-1 neatšķīrās DNS sintēzē. Tajā pašā laikā slurry kultivēšanu hondrocītus agarozes barotnē papildināta ar serumu, tika pievienots ar paaugstinātu iekļaujot radionucleotide 3 H-timidīna, salīdzinot ar citām vidēm.
C vitamīns ir nepieciešams, lai aktivizētu fermentus, kas iesaistīti kolagēna fibrila stabila spirālas struktūras veidošanā. Hondrocīti, kas ir nepietiekami attiecībā uz askorbīnskābi, sintezē zemu hidroksilētus neheriālos kolagēna prekursorus, kuri lēnām izdalās. Askorbīnskābes (50 μg / ml) ievadīšana izraisa II un IX tipa kolagēna hidroksilāciju un to sekrēciju normālos daudzumos. C vitamīna pievienošana neietekmēja proteoglikānu sintēzes līmeni. Līdz ar to kolagēna sekrēcija tiek regulēta neatkarīgi no proteoglikāna sekrēcijas.