Embrionālās cilmes šūnas

Par embriju cilmes šūnu atklājums - nebija nejaušība, un parādījās sagatavota augsnes izpētes jomā attīstības bioloģijas pētījumiem. Termins "cilmes šūnu" tika ieviests medicīnā 1908. Gada biedrības Hematoloģija kongresā Berlīnē, Aleksandrs Maksimovs piemēroti asinsrades šūnām. Ilgi pirms izolēšana un sagatavošana no stabilām līnijām pluripotento embriju cilmes šūnas, kas ir agrīnā attīstības pētīšanas procesā izmanto kāts terato- (embrija-karcinomas šūnas, ar kuru pētīja nezināmas mehānismus embryogenesis, ieskaitot secības ekspresijas agrīnās gēnu un proteīnu produktu par to darbu.

Bet vai cilvēka genoms toksitozi neatgriezeniski zaudē evolūcijas procesā? Nē, un embriogeneze ir pierādījums. Ja tas tā ir, tad, kad principā tiks īstenots evolūcijas attīstības otrais ceļš? Droši vien, kad cilvēks atstāj Cosmos, kur vides apstākļi būs relatīvi nemainīgi diezgan ilgu laiku. Kaulu zudums (kaulu demineralizācijas tādā bezsvara stāvoklī), ļoti lēni pakļaujas remodeling un reģenerācija var uzskatīt par pirmo soli uz cilvēka adaptācijas procesam kā sugas eksistences telpā. Tomēr maksājums par otro evolūcijas attīstības ceļu būs atšķirīgs - sterilitāte būs cena, lai atmaksātu visas totipotences un absolūtās plastika šūnas. Tātad vairoties šajā "evolucionāro hameleonu" pasaulē nebūs miozes, otpočkovaniem. Bet mēs dzīvosim ilgi. Telomerāzes nemirstība ir amobu nemirstība. Daudzķermenīšu organismā cilmes šūnas ir kvantitatīvās un kvalitatīvās ilgmūžības substrāts.

[1], [2], [3], [4]

Embrionālo cilmes šūnu avoti

Šodien avoti embrionālo cilmes šūnu laboratoriskiem testiem ir līnija peļu teratokarcinomas (129 / sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, Ri, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb) un cilvēka teratokarcinomas (NTERA-2, TERA-2 , H-9 klons), kā arī Hess Trauneona. Tomēr klātbūtne detalizēti mobilo pasi norādot imūno fenotipu, hromosomu analīzes rezultātus mRNS ekspresijas profilus pakļauti receptoriem un proteīnu starpšūnu signalizācijas nekompensē būtiskiem trūkumiem teratokartsinomnyh līnijas ESC - strauju zudumu totipotency un neiespējamība pieteikuma klīniskajos pētījumos, un jauktā diferencēšanu kultūra ir ļoti grūti izolēt tīrs veltīta līniju no neviendabīgo šūnām. Tāpēc parasti avots ESC līnijas ražotas klīniskiem mērķiem, kalpo kā iekšējo šūnu masu blastocistas, embrijiem, individuālie blastomeres no 8-šūnu attīstības stadijā, šūnas morula vēlāk posmus, un galvenais par cilmes šūnu.

Jāatzīmē, ka teratokarcinomas šūnas, lai arī tām ir pluripotences īpašības, ir ievērojami mazāks pluripotent potenciāls salīdzinājumā ar ESK. Viņu integrācija ar embrionālajām šūnām reti rada viļņu veidošanu, turklāt gametes ar teratokarcinomu šūnu genotipu nekad nav veidotas. Tiek uzskatīts, ka tas ir saistīts ar biežu rašanos šūnu kultūru teratokarcinomas hromosomu anomālijas laikā: no Y hromosomas, trisomiju šķirnes, svītrojumiem vai translokācijām zudumu.

Centieni atšķirt cilvēka ESK līniju tika veikti daudzas reizes, taču šo uzdevumu nevarēja atrisināt, jo normāliem cilvēka blastocistiem ir grūti piekļūt objektiem. Turklāt cilvēkiem cilvēkiem hromosomu patoloģiju biežums ir lielāks nekā dzīvnieku embriogenezē. Lielākā daļa agrīnu cilvēka embriju, kas iegūti pēc in vitro apaugļošanas, izraisa haotisku hromosomu mozaicismu un bieži vien ir skaitliskas un strukturālas izmaiņas. Pat vēlāk, blastocistu stadijā tikai 20-25% cilvēku embriju sastāv no šūnām ar normālu kariotipu. Tas bija gandrīz neiespējami izmantot šādus embrijus, lai izveidotu ESK, jo zigotes parasti tika audzētas divu vai četru blastomeru stadijās un pēc tam transplantētas dzemdē. Tikai salīdzinoši nesen bija drošs paņēmiens, kas izstrādāts apaugļotu cilvēku olšūnu audzēšanai blastocistu stadijā. Šīs metodes ieviešana in vitro apaugļošanas praksē ne tikai palielināja veiksmīgas implantācijas iznākuma biežumu, bet arī padarīja parastos blastocistis pieejamāku objektu.

Vēl pluripotentā cilmes šūnu avots ir galvenais dzimuma šūnas, kas, atšķirībā no vairāk uzlabotas cilmes iedzīvotāju germenativnogo epitēlijs, nav uz virsmas beta-integrīnam, bet izteikt augsta aktivitāte shelochnoy fosfatāze. Jāatzīmē, ka eksperimentā no pagājušā gadsimta astoņdesmitajiem gadiem tika pētīta cilmes šūnu populācija, kas veidojas no primārās dzimuma šūnas. Tajā pašā laikā tika izstrādāta tehnika, lai izolētu primārās dzimumšūniņas no peles embriju gonādu rudimenta. Pirmie neveiksmīgi rezultāti kultivējot aizmetņu dzimumšūnas in vitro liecina bezjēdzību šiem centieniem, kā šūnām, lai gan izdzīvoja, bet nav vairoties un mira pirmās dienas laikā. Vēlāk tika konstatēts, ka primārie peļu cilmes šūnas vairoties in vitro klātbūtnē tikai barotnē šķīstošo un membrānu saistās specifiski polipeptīdu augšanas faktoriem. Daudzi pētījumi liecina, ka tas ir nepieciešams klātbūtni šajā barotnē ne tikai LIF, bet membrannosvyazannyh un tērauda šķīstošo faktoru (SIF) izdzīvošanas un vairošanās aizmetņu cilmes šūnām. Šie peptīdi tiek ražoti ar ŠŪNU embriju homozigotas par mutāciju tērauda, un viens no tiem ir ligands no proto-onkogēna cKit.

Zīdītāju un cilvēku primāro cilmes šūnu ekstragonadalitāte ir dzimuma šūnu līnijas klona attīstības avots. Sākot līnija pirmatnējs dzimumšūnas, kā arī visus audus embriju un extraembryonic mesoderm dod epiblast (primārais ektoderma) agri embriji mozaīkas strukturālā organizācija. Agrīnie embriju dažādu daļu mikroķirurģiskā noņemšana izveidoja lokalizācijas zonu sākotnējā cilmes šūnu prekursoru klīnā. Ar rodamindekstrana kas tika izmantots kā šūnu marķieri, tā konstatēja, ka prekursori pirmatnējs cilmes šūnas atrodas proksimālajā reģionā epiblast, netālu no extraembryonic ektoderma. Primārā seksuālā šūnu līnija rodas no 45 šūnu klona, kura sadalījums notiek gastrulēšanas sākumā. Tad notiek klonu segregācija, un gastrulēšanas laikā primārās dzimuma šūnas nonāk ekstraembrionālajā mezodermā un atrodamas alantoīdu pumpuru pamatnē aiz primārās joslas. No turienes primārās cilmes šūnas migrē uz endocervīda endodermas ventrālo galu un pēc tam aktīvi pārvietojas pa dzirnavu dziedzeru, migrācijas beigās apdzīvojot dzimumorgānu veltņus. Migrācijas procesā, kā arī pirmajās 2-3 vietās noteikšanas dienās gonadu rudimentā, primārās seksuālās šūnas aktīvi izplešas un iziet astoņus replicējošos ciklus. Ja migrācijas sākumā ir apmēram 50 primāro cilmes šūnu, pēkšņu embriju reproduktīvās cistas ar 12 dienu attīstību, primāro dzimuma šūnu skaits pārsniedz 25 000.

Funkcionālā līdzība ESP un aizmetņu cilmes šūnu demonstrē pilnīgu iekļaušanu dalību šajās aizstāšana blastocistas iekšējās šūnu masas un turpmāku pilnīgu attīstību embrija, audu iekaisumu, kurš sastāv tikai no pēcnācējiem pirmatnējs dzimumšūnas. Saskaņā ar citiem raksturlielumiem peļu primārās dzimumšūnas PGCs bija arī identisks, parādot spēja atšķirt dažādos virzienos, lai veidotu embryoid struktūras in vitro, a in vivo forma teratomas kad injicējot subkutāni imūndeficīts pelēm atgādina spontānas teratomas sēklinieka pelēm line 129 / ter.

Ir noskaidrots, ka, kad pievienota LIF nesējā, un šķīstošo membrannosvyazannogo SIF izolēta primārās dzimumšūnas no 8.-dienas peļu embriju izdzīvot un vairoties kultūrā 4 dienas, bet pēc tam die. Turklāt termiņš, kad kultūra nāves novērota aizmetņu dzimumšūnas sakrīt ar posmu attīstības peles embriju (12.5-13.5 dienas), kad pumpuri primārie dzimumdziedzeru sieviešu cilmes šūnām ieiet mejozes un vīriešu pirmatnējs cilmes šūnām tiek bloķēti mitozes sadalīšana. Tomēr, ja jūs pievienot uz vidi, ne tikai augšanas faktori LIF un SIF, bet arī FGF2, tad galvenais cilmes šūnas turpina proliferirovat un subkultūras veidojas šūnu kolonijas var vairoties pat pēc izņemšanas no vides augšanas faktoru (SIF un FGF). Šādas šūnas var būt kultivētas uz ilgu substrāta embrija fibroblastu nepievienojot šķīstošā augšanas faktora LIF. Tās ir tādas stabilas šūnu līnijas, kas iegūtas no primārajām cilmes šūnām, kuras ierosināja saukt par embrija cilmes šūnām. Šis termins nevar tikt uzskatīts par veiksmīgu, jo, kad kultivētās EG-šūnas nevar iegūt embrionālās dzimumšūnas, kas spēj veikt visus turpmākos posmus ooģenēze vai spermatoģenēzi. Tas ir saistīts ar faktu, ka EG-šūnu līnijas, kaut kas iegūtas no aizmetņu cilmes šūnām, bet kultūrā iegūt īpašības embrionālo pluripotento cilmes šūnu zaudē spēju nodarīt šo germenativnye līniju. Citiem vārdiem sakot, galvenais cilmes šūnas audzēšanas laikā zaudē savas īpašības dzimumšūnas pārveidota prekursoriem un ESC, piemēram polipotentas šūnām.

Tiek atzīmēts, ka tad, kad ievada imūndeficīta EG pelēm, teratomas nerodas. Tiek pieņemts, ka cilvēka EG šūnu spēja paātrināt teratomu ierosināšanu ir saistīta ar faktu, ka šīs līnijas neveidoja tieši no kultivētām primārajām dīgļām, bet tika iegūtas no šūnām, kas izolētas no embriju orgāniem. Tāpēc ir iespējams, ka tie ir pluripotentnieces pēcnācēji, bet jau jau veiktie šūnas.

Jāatzīmē, ka starp EG šūnām un primārajām cilmes šūnām pastāv būtiskas atšķirības. Pēdējie nedod iespēju iegūt himērus peles embrijus, kas norāda uz primāro cilmes šūnu spējas integrēties iekšējā šūnu masā vai tropektodermā. Primāro dzimumu šūnu populācijas īpašības ir vairāk līdzīgas saistītajām vēlāko embriju somatisko šūnu līnijām, kuru ievadīšana blastocitā arī neizraisa kimēru embriju veidošanos.

Modifikācijas metodes kultivēšanu embryoid struktūrām, kas iegūti ar EG-apkopošanu, kurus atlases atļauto selektīvu vidi, lai saņemtu citu populāciju polipotentas šūnas šūnas, ko sauc par iegūti no embryoid struktūrām (embryoid ķermeņa derived celis - EBD-šūnu) "šūnas. EBD šūnu spēja ilgstoši vairoties kultūrā ļauj veidot stabilas šūnu šūnu līnijas. Tika iegūti šūnu kloni, kas ekspresēja plašu spektru mRNA un specializēto šūnu proteīnu marķierus. Šī pieeja, kā rezultātā izrādījās, ka galvenais seksa cilvēka pluripotentam šūnas, un diferencēt in vitro dažādos šūnu tipos: neironi, glia, asinsvadu endotēlija, asinsrades šūnas, muskuļu un endodermal šūnām.

Embrionālo cilmes šūnu alternatīvie avoti

Cilvēka ESC līniju alternatīvs avots var būt hibrīda šūnas. Implantācija uz dzemdes pseudopregnant govs geterogenomnoy struktūru, kas iegūta, kad apvienojot ar elektroporācijai fetusa cilvēka somatiskās šūnas ar olu govīm, kas iepriekš tika izņemtas no pronucleus, ļauj saņemt iekšējo šūnu masu pirms implantācijas embrija mākslīgo attīstības posmos. Šim nolūkam pirmajā solī tiek iegūts no blastocistas olu govi ar transplantētu cilvēka šūnas kodolā.

Otrajā posmā embrioblastu ekstrahē no blastocista, un no tā - ESK saskaņā ar Thomson metodi. Jāatzīmē, ka labākos rezultātus atdalīšanas ESC līnijām ar šo metodi tika iegūti, izmantojot serdes folikulu šūnām vai aizmetņu cilmes šūnas, kas saglabājas cilvēka ķermeņa stāvoklī guļas. Tas ir saistīts ar faktu, ka govs olas pārstādīti cilvēka šūnas kodols neukorochennye jābūt augsta aktivitāte un telomere telomeazy kas novērš priekšlaicīgu novecošanos ESC klonus, kas iegūti no hibrīda olu (Repina, 2001). Ir zināms, ka vissvarīgākie intracelulārie marķieri EGF proteīni ir Oct3, Oct4, Tcf, Groucho, kas pieder pie tā sauktajiem hromatīna silencer proteīniem. Klusinātāji nodrošina īpaši kompaktu heterohromatīna iepakojumu, kas neļauj veidot euchromatīna cilpas. Hromatīna komplekts, ko ietekmē šie proteīni, korelē ar ESC genoma toksitipiju. Līdz šim ir konstatēts, ka nobriedušas liellopu un cilvēku olšūnas ir vienīgais specializēto šūnu tips, kas citoplazmā satur augstu duslinieku olbaltumvielu koncentrāciju. Pamatojoties uz to, tika izstrādāta metode hibrīdu ESC ražošanai, pārnesot somatisko šūnu kodus govju bez kodola ovulām. Iepriekšējie pētījumi in vitro ir parādījuši, ka govju olšūnu citoplazma atjauno cilvēka somatisko šūnu kodola genomu totipotenci pēc 12-24 audzēšanas stundām.

Īpaša interese ir dati par cilvēka embriju preimplantācijas attīstības pazīmēm, kas liecina par totupozītu šūnu vēlāku nomaiņu ar pluripotentām šūnām, nekā pelēm. Pētījums par šūnu transformācijām parādīja, ka cilvēka blastocistas iekšējās šūnu masas šūnas, papildus ESK, arī rada trofoblāta šūnas, kas norāda uz to kopējo iedarbību.

Ir zināms, ka blastocistas stadijā ir divas atšķirīgas ķermeņa šūnu populācijas. Viens no tiem ir blastocistas ārējais slānis, trofektoderms, kas iegūts no trofoblasto šūnām un citiem embriju placentas komponentiem. Otrā šūnu populācija tiek sagrupēta blīvā masā, kas saskaras ar tropektodermas iekšējo virsmu. Iekšējo šūnu masas šūnu populāciju iegūst no visiem embriju orgānu audiem un baktērijām. Vēlas blastocistu stadijā no iekšējās šūnu masas veidojas ārpus embrionā endodēma, un veidojas epiblasts (primārais ekoderms). Tajā pašā laikā epiblasta šūnas saglabā pluripotenci, bet spēja diferenciozēt ekstraģenerālo endodermu šūnas ir ierobežota.

[5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]

Cilvēka embrionālo cilmes šūnu iegūšana

Vēl nesen tika uzskatīts, ka trophoblast iegūts no hESCs neiespējami. Tomēr diploīdiem line trophectoderm cilmes šūnas, kas izdalīti no Blastocistas vidē, kas satur, tā vietā, lai LIF un FGF2 heparīnu, vairošanos, un tiek pārveidots cilmes šūnas. Ja jūs izņemt no vidū FGF2, tad trophectoderm šūnas apstāties audzēšanu, viņi sāk endoreduplikācija hromosomas un mobilo elementu trofektodermalnye pakāpeniski pārveidota milzu trophoblast šūnām. Iespējams, LIF nestimulē proliferāciju trophectoderm šūnas sakarā ar to, ka FGF2 aktivizē mehānismu transsignalizatsii kā FGF2, saistoties ar citoplazmas receptoru (FGFR2), aktivizēt, MAP kināzes citoplazmā - ERK1 un ERK2. Līdz ar to, kad tas ir iestrādāts šūnām Blastocistas vienu signāla ceļā (LIF - gpl30 - JAK-kināzes - STAT3) iekšējās šūnu masas šūnas tiek pārveidots polipotentas hESCs, kamēr aktivizējot otro mehānismu transmembrānu signalizācijai (FGF2 - FGFR2 - MAP kināzes ERK1 / ERK2) cilmes šūnas blastocistas trophectoderm veidojas. Atlase no signāla ceļā, savukārt, ir atkarīgs no darbības gēnu oct4. Šis gēns, kas pieder POU domēns, kas atrodas pie lokusa t 17 autosomes un tiek izteikts ooģenēze laikā, saspiešanas periodu, kā arī šūnās iekšējās šūnu masas Blastocistas, un jo aizmetņu cilmes šūnām. Funkcionālā loma oct4 gēns tiek kodē transkripcijas faktoru, kas vajadzīga, lai rašanos polipotentas šūnas, to diferenciācijas un dedifferentiation.

Oct4 gēna izteiksme ESC atšķiras atkarībā no šī transkripcijas faktora un kopfaktoru mijiedarbības. Virziena izteiksme regulējums oct4 jo blastocysts parādīja, ka tās darbība zemākām pusi veidos trophectoderm šūnas, bet pie augstākas inducēto izteiksmes oct4 rodas galvenokārt hESCs.

Eksperimentā ESC nevar tulkot rindā pēc kultivēšana totipotentām blastomeres šķelšanās posmā un posmā gastrulation un vēlīnā embrionālo attīstību. Peles ESP parasti piešķirt pie 3.5-4.5 dienu grūtniecības, kas atbilst sestajai (vienslāņa blastocistas) un septīto posmu (divslāņu blastocistas - agrīna ola cilindrs) normāli embrioģenēzes. Acīmredzot tikai preimplantācijas periodā peļu embriji satur šūnu populācijas, kuras var pārvērst ESK. Līdz ar to ESC līniju izolēšana ir iespējama tikai noteiktos embriogēnās attīstības posmos. Totipotentām, attiecībā iespējām attīstības dzīvotspējīgu embriju no embrija membrānas un placenta ir zigota un rodas smalcināšanas blastomeres laikā. Zarnu šūnu kopējās iedarbības zudums sākas vēlā morula stadijā, kad turpmāka blastomēra smalcināšana ir atkarīga no to atrašanās vietas. Agrīnie morula blastomeres saglabāt totipotency kā eksperimentāla manipulācija ar mainot to atrašanās vietu, piemēram, apgriežot to atrašanās vietu, neliedz attīstību augstas kvalitātes embriju.

Tika konstatēts, ka ESK izdalīšanās efektivitāti līnijā ietekmē blastocistu stāvoklis to paskaidrojuma brīdī. Par blastocysts lietošana pēc septiņu dienu simulāciju diapause ar dzimumorgānu trakta pelēm, ovarektomija pie 3,5 grūsnības dienai un apstrādāts ar progesteronu, veicina veiksmīgāku atdalīšanas līniju embrionālās cilmes šūnas. Tiek pieņemts, ka šādos apstākļos palielinās blastomeru skaits, kas veido iekšējo šūnu masu. Ir arī iespējams, ka šūnas cikls paplašinās, un lielākā daļa blastomeru nonāk G0 fāzē.

Turklāt, izveidojot stabilu polipotentas embriju cilmes šūnu līnijas, ir atkarīgs no genotipa embrijiem: diezgan viegli atšķirt no ESP peļu un žurku blastocysts līnija 129, ir ievērojami grūtāk tos iegūt, izmantojot peles CS7BL / 6 un praktiski neiespējami izolēt līniju no hESCs blastocysts CBA / Ca pelēm. Acīmredzot agrīnajiem embrijiem piemīt dažas ģenētiskās īpašības, kas ietekmē pluripotentās ESC līnijas attīstību. Tomēr, ja kultivētas epiblast izolāciju, kā arī ar selektīvu atlasi atšķirošais hESCs šūnu līniju no sākuma embrijiem vēl tika piešķirti CBA / Ca pelēm.

Pierādīta standarta metode ESK līniju iegūšanai no blastocistiem ir dota laboratorijas rokasgrāmatās par eksperimenta metodi ar agrīniem embrijiem. Eksperimentālās ESK līnijas var iegūt, arī kultivējot 4,5 dienas peļu embriju izolētu epiblastu (primāro ektodermu) ar diezgan sarežģītu mikroķirurģisko tehniku un modificētiem audzēšanas apstākļiem. Šīs procedūras sarežģītība ir pamatota, jo ESK līniju veidošanās biežums bija daudz lielāks nekā darbā ar blastocistas iekšējo šūnu masu.

Lai izolētu ESC līnijas, katrs klons tiek pārvietots uz mikrokameru, tiek audzēts kopums no 40-60 šūnām, tas atkal izkliedēts. Vairāki atkārtojumus šī procedūra ļauj iegūt iemūžināts Esko līniju ar pievienotajiem plastmasas, kas caur eju 50-100 saglabātu totipotency un augstu telomerase aktivitāti maksimāli proliferācija normokariotipnyh šūnām. Šajā procesā atbalstīt līnijas ESC vislielākais risks ir piesārņojuma vai seruma baktēriju endotoksīni - pat pēdas endotoksīna koncentrācija barotnē izraisīja masveida nāves nenobriedušu dzimumšūnām. Ar rūpīgu kontroli lineārās izaugsmes un savlaicīgi dispersija ESP kultūrā spēj simetriskā dalīšanās, kurā abas meitas šūnas joprojām pluripotentā un spēj veikt neierobežotu skaitu šūnas ciklu, saglabājot diploīdo kariotips un kopējo potenci.

Tīru cilvēku ESK populācijas izvēli var veikt pēc transfekcijas savā rekombinanto DNS molekulu genomā, kurā ir gēns, kas kodē zaļās fluorescējošās olbaltumvielas (GFP) sintēzi. Expression of GFP palielinās līdz ar pieaugošo ESP vidē, atbalstot to izplatīšanu, tā sākums diferenciāciju gēnu izpausmes līmeni, ir samazināts, kas ļauj izvēlēti uz selektīvajā vidē tīra stabila, polipotentas šūnu līnijas. Ja kultivē ar GFP selekciju ESC, koloniju biežums ir ievērojami palielināts, jo selekcijas apstākļos tiek likvidēts diferencēto šūnu spēcīgais antiproliferatīvs efekts.

Tulkojums no cilvēka embrija cilmes šūnu līniju ar to metodi izolēšanas Pirmsimplantācijas embriju (step 80-120 šūnām), kas paliek pēc in vitro apaugļošanas procedūru. Šim nolūkam mākslīgi iegūtie "pārmērīgi" embriji ir mehāniski izkliedēti Delbecco-Needle vidē. Pēc iezīmēšanas šūnas ar monoklonālo antivielu selektīvu fluorescentu iezīmi embryoblast izolētām šūnām. Embrioblastu izkliedē atsevišķās šūnās, izmantojot disaspaza-kolagēzes maisījumu. Atdalāms šūnas tika audzētas īpašā vidē (80% Delbekko vidējā + 20% teļa augļa serums klātbūtnē IL-6, LIF un SCF 500 ug / ml), par vienslāņa embrija fibroblastu feeder 3 pirmos fragmentus. Tādējādi izdzīvošanas un proliferāciju cilmes un cilmes šūnu tiek uzturēta, saskaroties ar IL-6, LIF un SCF. Šajā vidē, atlikšanas hESCs augt kloni osharennyh atsevišķām šūnām tikt sadalītas ar maigu vairāku pipeti. 5.-7. Dienā jaunajā klonā parādās apturētā kultūra. ESK maksimālo augšanas ātrumu panāk, atkārtojot klonu disociāciju 10-15 šūnu stadijā. Pēc tam katrs klons tiek pārvietots uz mikrosūcienu un audzē līdz 40-50 šūnu kopumam. Procedūra tiek atkārtota vairākas reizes fragmentos, palielinot kultūras tilpumu līdz 5-10 miljonu šūnu blīvumam uz 6-centistu pušķi. Izmantojot šāda Thomson pārsējot tika izolēta 10 klonus nemirstīgās cilvēka ESP, kas caur ejām 100 saglabātu augstu telomerase aktivitāte, spēja uz intensīvu izplatīšanu un fenotips minimālais kopējais potences, diferenciāciju kādā no 350 specializēto šūnu līnijas, kas tiek iegūti ecto-, meso- - un endoderms. Diferenciācija cilvēka ESC sākās (pie maiņas vidēja, papildus un likvidēšanai seruma LIF) ar šūnu piestiprināšanai pie pamatnes, norādot attīstību ANOTĀCIJA Šūnas skelets un izpausmi adhēzijas receptoriem. Ir svarīgi, lai ar neierobežotu cilvēka ESK izplatību saglabātu normālu kariotipu.

Otra ESC līniju izolēšanas metode balstās uz primāro dzimuma šūnu izmantošanu. Eksperimentālie pētījumi liecina, ka Eu-šūnu līnijas var iegūt no dzimumorgānu plāksnēm ar 12,5 dienu veciem pelēm embrijiem. Tomēr šajos gadījumos cilmes šūnu līniju veidošanās biežums bija ievērojami zemāks nekā eksperimentos ar agrākiem embrijiem. Tajā pašā laikā primārās dzimuma šūnas no peles embāņu gonādiem ar 13,5 dienu gestācijas vecumu parasti nespēj pārveidot līnijās.

Pirmie stabilas pozīcijas cilvēka polipotentas EG šūnas tika iegūti no primārajiem gonocytes izolēti no dzimumorgānu primordia 5-9 nedēļas veciem embriju. Izolētas šūnas tika kultivētas uz substrātu inaktivēta peles embrija fibroblastu in DMEM barotnē ar augļa serums, kam pievienoja merkaptoetanola, forskolin, kā arī rekombinantas cilvēka augšanas faktoru (FGF un LIF). Pēc 7-12 dienām daudzķēdes kolonijas parādījās kultūrā, saskaņā ar morfoloģiskajām īpašībām un molekulārajiem marķieriem, kas atbilst cilvēka EG šūnām. Pēc agregācijas šajās šūnās izveidojās embriju struktūras, kuru attīstība parādījās specializētām šūnām, kas raksturīga visu trīs embriju lapu atvasinājumiem. Visās 10-20 pārejās EG-šūnu līnijas saglabāja normālu kariotipu un nezaudēja pluripotenci.

Ir arī pierādīts, ka LIF, membrānas saistīto un šķīstošo tērauda faktoru, kā arī TGF-b, kopējā ietekme groza primāro cilmes šūnu attīstības programmu. Tā vietā, lai apturētu mitozes sadali un sāk diferencēt pret oogēni vai spermatogēniju, primārās seksa šūnas turpina izplatīties. Pēc vairākiem papildu mitotiskiem cikliem tie kļūst līdzīgi epiblasto šūnām un, zaudējot sugu cilmes šūnu prekursoru īpašības, tiek pārveidoti par pluripotentām embrija šūnu EG šūnām.

Tādējādi 1998. Gadā primārās seksuālās šūnu nemirstīgās līnijas vispirms tika izolētas no cilvēka augļa atklāšanas audu seksuālajiem rudimentiem. Par cilvēka primārajām dzimumšūnām embrioģenēzes parādās dzeltenummaiss trešajā nedēļā attīstību un uz 4-5th nedēļās, šīs šūnas migrē uz seksuālās paugura, kur tie veido iedzīvotāju primāro dormantnye gonocytes. Inaktīvā stāvoklī primārās cilmes šūnas paliek pumpurē līdz dzemdībām. Galvenais dīgļšūnu līnijas tika iegūti no augļa dzimumorgānu tuberkulam 5-9 nedēļas veciem embriju izgūti ex tempore audums, kas tiek ārstēti ar maisījumu kolagenāzes tipa IV-V, hyaluronidase un DNase kvantitatīvai un kvalitatīvai pieaugums šūnu ražu. Sākotnējās dzimumšūniņas augļa dzimumorgānu audzē audus ieskauj Sertoli stromālās (mezenhimālās) šūnas. Functional mērķis sertoli šūnām ir ražošanas anti-apoptotisko faktori (Fas-ligandu), mitogēniem, un Imūnsupresīvo kas aizsargā seksuālās cilmes šūnas no imūnās uzbrukuma organismā. Turklāt dzimumorgānu tuberkulozes stromālās mikromasā ir svarīga loma gametu nogatavošanā. Izolētās primārās cilmes šūnas tiek stādītas kultūrā virs barības stromas slāņa, kas sastāv no pirmās trīs ejas augļa fibroblastām. Visefektīvākā mitogēnu kombinācija ir komplekss, kas sastāv no LIF, FGF un forskolīna (stimulatora cAMP veidošanās). Ieroču neizplatīšanas pirmatnējs cilmes šūnās in vitro pieprasīt pievienot augļa serums, klātbūtnē primāro reprodukcijas gonocytes kultūrā kloniem, ko pavada veidošanās lodveida, non-blakus esošajiem šūnas ar pamatni.

ASV National Institutes of Health pamatojoties uz apkopojot esošo informāciju par metodēm cilvēku ESP līniju no blastocysts sadali tika iepriekšēju secinājumu, ka veiksmīga sadale ESP, visticamāk, ja kultivētas blastocysts ar labi izveidota iekšējā šūnu masa (Cilmes šūnas: zinātnisko progresu un turpmākās pētniecības virzieni Nat.Instit, Veselības ASV). No šī viedokļa, labākais avots ESP izveidot līnijas ir cilvēka blastocistas 5. Diena attīstību, kuras iekšējās šūnu masas sadalījums būtu rūpīgi noņemtu trophectoderm. Izolēta iekšējais šūnu masa, kas sastāv šajā posmā 30-35 šūnas ir jāaudzē substrātam peļu embrija fibroblasti, kas ir noteicošais nosacījums veidošanās koloniju kultūras hESCs.

Embrionālo cilmes šūnu fenotipisko pazīmju analīze

Īpaša uzmanība ir ESK fenotipisko īpatnību starpnozaru salīdzinošā analīze. Tika konstatēts, ka cilvēka ESC kolonijas - blīvu kopas saplacināts epitēlija šūnas, bet pelēm embryoid teļu sastāv no vaļēju konglomerātā noapaļotiem šūnām. Cilvēka ESK kodola un plazmas koeficienta indekss ir mazāks nekā ESK pele. Monkey embrionālās cilmes šūnas veido plakans kolonijas vairāk robiem šūnas. Agrīnās ESK primātu klonos viegli redzamas atsevišķas šūnas. Proliferējošu hESCs visu sugu dzīvnieku neizsakām MHC klases I un II. Tajā pašā laikā, cilvēka ESP dot pozitīvu reakciju uz antivielām tera 1-60 un GCTM-2, kas norāda uz to, ka uz to virsmas keratin / hondroitīna sulfāts proteoglikāniem embrija (teratomas) raksturīgs -kartsinomnyh cilmes šūnas. Izteiksme hESCs visi dzīvnieki oct4 gēna veidu liecina, ka, neraugoties uz fenotipisko atšķirībām cilvēku un peles ESP, acīmredzot aktivizē paša komplekta gēnu, kas atbild par uzturēšanu pluripotency (Peru, 2001). Turklāt ESC līnijas, kas iegūtas no embrija žurkām, cūkām, trušiem, primātiem, un liellopu, ir līdzīgas morfoloģiskās iezīmes, līdzīgai molekulāro identifikācijas marķieru un gandrīz identisks molekulārais mehānisms, lai īstenotu embrioģenēzes programma, kas ļauj jums veikt svaigu apskatīt ksenotransplantācija jautājumu .

Atšķirībā no normāla embryogenesis in vivo, in vitro proliferācija hESCs nav pievienoti veidošanās dīgļa slāņiem un turpina bloķēt homeotic Nohgenov fona, t.i., bez Organoģenēzes. Tā segmentācijas gēni nav darboties kultūras hESCs iespējams atveidot šādus laikposmus embrioģenēzes kā ciļņu segments segmentācijas kodola, veidojot dzeltenummaiss, allantois provizorisks un citos orgānos un audos. Kultūras ESK tika iesaldētas jau 350 specializētu šūnu ierobežošanas līniju veidošanās sākumā. Tādējādi klons meitas cilmes šūnas un centralizēti lokalizētu PGCs tikai modelim embrijs izstrādes laikā, kad dažādu audu reģioni tiek veidoti vienā posmā atšķiras no specializētām šūnām, kas iegūtas, tomēr no kopējiem prekursoriem. Lai gan minimālo līmeni receptori uz virsmas hESCs, tie saglabā spēju veikt primitīvus morfoģenētiskie procesus imitē lielāko daļu agrīnās embrija struktūras: Vircas hESCs kultūru un agregāti veido struktūru atgādina blastocistas vai pat vēlāk embriji (olu cilindri). Šādus suspensijas agregātus attiecīgi sauc par vienkāršiem un sarežģītiem embriju orgāniem.

Ja sajauc atšķirt dažādos šūnu embryoid ķermeņa vienlaicīgi, kas izteikti ar sākumā gēnu ektoderma (oct3, FGF-5, mezgla), endoderma (gata-4), mesoderm (brachyury), kardiogēns mesoderm (PKH-2,5), neironu caurule (msx3 ) un hematopoēze (elkf). Izmantojot dažādas kombinācijas citokīnu un augšanas faktoru, lai atlasītu veidošanos dzimumšūnu slāņa šūnās in vitro, kas vairākos gadījumos tas bija iespējams iegūt embryoid struktūras, kas tika vēlams, kas izteiktas gēnus ektoderma vai mesoderm, kas atver ceļu uz modelēšanai gastrulation un agrā organoģenēzes fāzē.

Klonu pieaugums hESCs ir pierādījumi par asimetrisku šūnu dalīšanās, kurā tikai viens no EsP centra klona saglabā ārpus ierobežo reprodukcijas spējas, bet otra meita šūna rada paaudzes cilmes šūnu, diferenciācija jau nāk. Tāpēc klons izplatīšanās ātrums perifērijā embryoid organismā ir augstāks nekā centrā. Robeža šūnas aug klons iziet spontāno diferenciācijas nekārtīgas migrēt vai mirt ar apoptozi mehānismiem. Šie notikumi noteikt likteni klona ja izplatīšanu ātrums pārsniedz ātrumu migrācijas un apoptotisku šūnu nāvi, klons izmēri turpina pieaugt, stabilizācija notiek ar vienādu apoptozes un likmi veidojot jaunas šūnas ātruma, regresijas - apgriezto attiecību šiem procesiem. Cilmes šūnas sadalīt simetriski, ti, abas meitas šūnas vēlāk diferencēt vērā nobrieduši specializēto šūnu līnijām. Par ESC / cilmes šūnu proporcija mainās, bet vienmēr skaits vienoto kontaktpunktu ir tikai daļa no vienu procentu no iedzīvotāju cilmes šūnām. Tāpēc, tikai ar rūpīgu un savlaicīgus pipetēšana apkopojuma kloni spēj palielināt skaitu ESP kultūrā. Sadalījuma kloni parādījās solī 10-12 šūnas ir efektīvs, lai iegūtu maksimālo ražu hESCs. Šūnu diferenciācijas virziens un pakāpe embriju ķermenī ir atkarīga no to atrašanās vietas. Ārējie embryoid ķermeņa šūnas neizsakām gēnu un oct4 iziet diferencēšanu primārās endoderma šūnās, no kura vēlāk veidojas epithelioid šūnas un parietālo extraembryonic viscerālo endoderma. Embriju ķermeņa iekšējās šūnas izsaka oct4 gēnu un saglabā pluripotenci 48 stundu laikā. Bet tad morfoloģiskā reorganizācija notiek epitēlija vienslāņa kultūra sākas un gēnu, kas kontrolē attīstību primārā ektoderma. Turklāt process kopējā nekārtīgas cytodifferentiation sākas ar izskatu dažādu šūnu veidiem, kas ir atvasinājumi visu trīs dzimumšūnu slāņiem. Šajā procesā spontānu diferenciācijai embryoid ķermeņa šūnām rasties pirmais Aggregates endoderma marķierus formā fragmentiem (cistas) dzeltenummaiss. Turklāt šajās struktūrās parādās audzēju kapilāru angioblasti un endotēlija šūnas. Jo pēdējos posmos spontānu diferenciācijai iekšējo šūnās embryoid ķermeņa attīsta dažādas nedziedināmi diferencētas šūnas, ieskaitot neironi, glijas elementi, kardiomiocītos, makrofāgi un eritrocītos. Dažās tuvināšanu (ņemot vērā telpisko apvēršanu lapu veido embrija audu), izmantojot embryoid institūcijām in vitro var izpētīt morfoģenētiskie procesus un analizēt molekulāro mehānismus embrija cytodifferentiation sākuma periodā, un izveidot lomu specifisku gēnu īstenošanā šiem procesiem.

Tādējādi klonā ir šūnas, kurās tiek atklātas dažādas ģenētiskās attīstības programmas - ESK, agrīnā progresori un diferenciozes priekšteču populācijas. ESK audzēšana, izmantojot pazemojošas pilnas vai masas kultūras metodes bez barošanas slāņa un bez LIF pievienošanas vidē neizbēgami noved pie embriju struktūru veidošanās. Embriju struktūru ārējo un iekšējo slāņu šūnu morfoloģija ir atšķirīga. Ārējais slānis sastāv no lielām procesa šūnām. Viņu virsma, kas vērsta pret vidi, ir pārklāta ar daudziem mikroviļņiem. Šūnu ārējais slānis ir atdalīts no iekšējās bazālās membrānas, kas atgādina Reichert membrānu, savukārt embriju ķermeņa iekšējā slāņa šūnas ir cilindrisks epitēlijs. Morfoloģiski iekšējais slānis, lai gan satur daudzas dalāmas šūnas, vairāk atgādina nediferencētas ESC kolonijas.

Cilvēka embrionālo cilmes šūnu īpašības

Nav parenhimatozajās-mezenhīmas mijiedarbību pie fona signāla bloķēšanas gēnu homeosis izraisa nekārtīgas izaugsmi PGCs kultūrā, jo šī cilne ir bojāta, un veidošanās infrastruktūras provizorisks orgānos. Neorganizēti izaugsme un neprognozējamu spontāni diferenciācija hESCs kultūrā trūkuma dēļ mezenhīmu marķējuma stromas pamatu nākotnes struktūras: in vitro, tas ir iespējams, veidošanās miljoniem hepatocītu, bet jūs nevarat saņemt jebkuru segmentu aknas, ieskaitot šādu strukturālo un funkcionālo elementu, piemēram, deguna blakusdobumu, telpu Disse un Kupfera šūnām.

Tiek uzskatīts, ka pluripotency ESP realizēta tikai embrioģenēzes veido audus un orgānus embriju, bet nabassaite un placenta ir atvasināti trophoblast. Ievietojas čaulā trofektodermalnuyu ESK konsekventi radīt šūnu kloni Provizoriski realizējot attīstības programmu ar kombinatorikas mRNS bulk Nohteyaov topogrāfiskās matricu, kas iepriekš noteikt telpiskā salikumā, kas ir tāda forma, skaits pagaidu un galīgo orgānu šūnas un parenhīmā montāžu uz strukturālo un funkcionālo vienību. Tajā pašā laikā ESC ir tikai šūnu veids, kurā molekulārā realizācijas mehānisms savu potenciālu pilnībā atdalāma no ģenētiskās programmas attīstības un ESCO paši liegta iespēja mijiedarbību ar citām šūnām blokādes dēļ gan receptoru uztveri un transsignalizatsii sistēmām. Tomēr atbilstoši aktivizēšanas ESP rezultāti pakāpeniski izvietošana embrioģenēzes programma nebeidzami dzimšanas ir pilnībā izveidota un gatava ārpusdzemdes dzīvi organisma veido miljardiem šūnu. Šajā īsajā laikā, bet iedomājama parāds šūnu kosmosa ceļu neizbēgama rašanās kļūdām molekulāro mehānismu, kas nodrošina dzīvības funkcijas šūnas, un programmas, kas kontrolē to izplatīšanu, diferenciāciju un specializāciju. Tāpēc mūsdienu farmakogenomikai uzskatīta atsevišķi slimību molekulārās ierīces, un slimība šūnu programmēšana. Un darbība vairumam jaunu medikamentu, kuru mērķis ir koriģēt programmas nosaukumu diferenciācijas, izplatīšanas un organoģenēzē, kā arī atjaunošanās orgānos un audos. Jo pieaugušo organismā caur ESP tas kļūst iespējams kontrolēt uzvedību cilmes / cilmes šūnu transplantātu uz smadzeņu, aknu, liesas, kaulu smadzeņu un citu orgānu cilvēka, lai labotu bojātas adresātu parenhimatozo orgānu dēļ diferenciācijas un specializācijas donora mezenhīmas šūnas konservēti matricu. Būtībā totipotency programma uzsāk vēl olšūna genomu līmenī zygotes un blastomeres, bet šie šūnas vēl nav iespējams klonēt un uzsējumu vajadzīgajos daudzumos vajadzībām experiental un praktisko medicīnu. Tāpēc ESC ir unikāls avots ģenētiskās informācijas satur trīsdimensiju lineāru ierobežojums karti embrija un uzvedības specializētiem šūnu līnijas gastrulation laikā.

Praktiski neierobežotas iespējas reģeneratīvās ESC sakarā ar to, ka to genomi, atšķirībā ģenētisko aparātu diferencētu somatisko šūnu, uztur pluripotency. Viena izpausme neaktīvā stāvoklī iesakņojies ESP ģenētiskās informācijas ir tā sauktā minimālā fenotips - uz virsmas ESP izteiktu ierobežotu skaitu receptoriem, un tāpēc izvietoti ļoti maz programmu, lai mijiedarbotos transsignalizatsii kodolenerģētikas aparātu šūnas ar savu mikrovidi. Ņemot vērā ziemošanas gēnu, kas atbild par ierobežojumu specializētu šūnu līniju un diferenciāciju šūnu, aktivizēt tikai aptuveni 30 no 500 gēnu, kuru produkti nodrošina saziņas šūnas ar apkārtējo mikrovidi. Izmantojot metodi sērijas analīzes gēnu ekspresijas parādīts, ka vispārējo raksturu galveno funkcionālo genomu kastes regulē enerģijas un vielmaiņas somatiskajām šūnām un ESP in pēdējiem nosaka ļoti zemu summu mRNS receptoru, G-olbaltumvielās, otrajā kurjeri, transcriptases, cofactors izteiksmi un represijas , tas ir, visa regulatīvā signāla pārneses membrānas sistēma šūnā. Tas ir saistīts ar transsanalizēšanas gēnu trūkumu vai ļoti zemu izpausmi. Diferenciāciju inducēto genomā ESC 18. Darbības laikā tiek pārtraukta sinhroni darbojas gēnus fons aktivizācijas transsignalizatsii 61 gēnu, kas kontrolē sintēzi šūnu adhēzijas receptoriem, ārpusšūnu matricas komponentiem, ierobežojums transcriptases messendzhernyh elementus un signāla pārvades sistēma, lai kodolaktīvās vienības ar plazmas šūnu membrānu receptoriem. Vienlaikus bloķēts gēnu, kas atbild par sintēzes proteīni trokšņa slāpētāju, kā arī gēnu ekspresiju koingibitorov nodrošinot totipotency genomu hESCs.

Ģenētiskie marķieri tika atrasti visu trīs embriju bukletu šūnās. Identifikācijas ectodermal šūnu slānis veikts uz gēnu mezgla, oct3 un FGF-5, mesodermal šūnas - gēns brachyury, zeta-globin, endoderma - pie gata-4 gēnu ekspresijas. Normālas embrioģenēzes, gastrulation laikā novērota aktīva migrācija nenobriedušu iedzīvotāju stumbru un cilmes šūnu, lokāli apzīmē teritorijas sejas kaulu no galvaskausa, daži smadzeņu, perifērās nervu sistēmas, sirds vadīšanas sistēmas un aizkrūts audiem daļas, kas ir veidotas no kloniem pārvietotas šūnas. šūnu marķēšanas agri gēni dīglis slāņi atvieglo topogrāfiskās analīzei migrācijas cilmes šūnu embrija attīstības. Tas ir atrodams it īpaši, ka šūnas agregāti embryocarcinoma P19 izpausmes pirmās gēnu mesoderm brachyury sākas samazināšanu gēnu ekspresijas audu plazminogēna aktivatora, a-fetoproteīna, keratīnu 8, un keratīna 19, kas ir marķieri agri mesoderm migrējošo iedzīvotāju laikā. Līdz veidošanās audos mesodermal izcelsmes sākas tikai pēc procesa migrācijas un nostādināšanas punktu mesodermal cilmes šūnām.

Ar ļoti ierobežotu fenotipa pazīmes un nepastāv vairums blokiem tomēr transsignalizatsii ESC izteikt dažus receptoru molekulas, kas var tikt izmantoti, lai identificētu tos. Jāatzīmē, ka antigēni ir marķieri ESK cilvēkiem un primātiem bija kopīgs. Visbiežāk izmanto, lai etiķete hESCs marķēto antivielas pret antigēnu membrannosvyazannym SSEA-3, SSEA-4 (unikālie lipīdu antigēni, kas pārstāv kompleksu glikolipīds GL7 ar siālskābes), kā arī augsta polimēru glycoproteins TRA-1-81, TRA-1-60. Turklāt, hESCs izteikt īpašu embrionālā antigēnu SSEA-1 un endogēno sārmainās fosfatāzes, kā arī īpašu transkripcijas faktora Oct4. Pēdējais ir nepieciešami, lai uzturētu hESCs izplatīšanas mehānismiem - specifisks transkripcijas faktoru Oct4 gēns aktivizē izpausmi fibroblastu augšanas faktors 4 gēnu ekspresijas un stabilizē boksa atbildīgs par non-ierobežojot DNS reduplikācija Nenobriedušiem šūnās. Svarīgākie iekššūnu marķierproteīnus ir Oct3, Oct4, TCF un Groucho, kas saistīti ar proteīnu hromatīna-trokšņa slāpētāju.

Gandrīz tūlīt pēc ilgtermiņa kultivētām ESP mēģinājumi ir neveiksmīgi, un organisms kultūra cilmes šūnās, kas izolētas no peles blastocysts un primārās cilmes šūnu kultūrā tika pirmoreiz sagatavots, sāka skatuves ESC pluripotency jaudas pētījumu, ievadot sākumposmā embriju attīstību. Tika pierādīts, ka pie morula un Blastocistas PGCs spēj izveidot himēro embriju, ja donors PGCs pēcnācēji konstatēti visās somatisko audos un pat gametu. Tādējādi, Attīstības bioloģijas izmantojot ESC skriptu "tiltu" starp eksperimentāliem pētījumiem in vivo un in vitro, kas būtiski palielinātu iespēju studēt procesiem grāmatzīmes primārās audus un orgānus, to diferenciāciju un embrija organoģenēzes.

Ir labi zināms, ka in vivo embrioģenēzes laikā ESK integrēta šūnu masa agrīnas embrija, un to atvasinājumi ir atrodami visos orgānos un audos. PGCs kolonizēt cilmes šūnu līniju himēriska cilmes šūnu, pēcnācēji no kuriem veido pilnībā olu un spermu. Embrionālās cilmes šūnas ir clonogenic - single PGCs var radīt ģenētiski identisks koloniju šūnas ar molekulāro marķieru, kas ietver oct4 gēnu ekspresiju un sārmainās fosfatāzes, augsta telomerase aktivitāti, kā arī izpausmi specifisku embrija antigēniem.

Izpētīt mehānismus embrioģenēzes izmantojot tehniku hESCs chimerization morula izveidojot bioloģisko struktūru, kas atrodas ārpus slānis tetraploīdiem blastomeres saņēmēja un donors PGCs tiek ievadīts. Tādējādi, trophoblast veidojas no pēcnācējiem tetraploīds blastomeres saņēmēju, ka ļauj implantēšanu un placentation un donoru PGCs kas darbojas kā iekšējās šūnu masas, kuru veido no dzīvotspējīgu cilmes šūnu līnijā primārā ķermeņa un cilmes gametu. Pētījums ESC vērtība slēpjas ne tikai, ka tad, kad manipulācija in vitro ar savu genomu saglabāts pluripotency, bet arī ar to, ka, lai gan saglabāšanas spēju piedalīties veidošanā hESCs pirmatnējais cilmes šūnās antihimērisko embriju. Ir pierādīts, ka tikai viens pēcnācējs no ģenētiski modificētu PGCs kolonizēt visu primāro un baktērijas, kas veido audumu himēro embriju, kas iegūta, izmantojot agregāciju vai coculture uz šūnām ar 8-šūnu embriju. Kad pārstādīt mice morula ESP transfecētas ar Proteīns GFP gēna, luminiscences pēcnācēji šūnas tika konstatēts visos pētītajos audos embrija attīstības (Shimada, 1999). Transplantācija ESC ar morula var izveidot dzīvotspējīgu peles, ķermenis sastāv tikai no pēcteči ziedoja ESC, kas paver iespējas dažādiem terapeitiskās klonēšanas iespējas. Tagad šāda metodiska pieeja ir veiksmīgi piemērota izpētīt problēmas attīstības bioloģijā, it īpaši, tas var analizēt ģenētisko mehānismus inaktivāciju X hromosomas vai epiģenētiska nestabilitāti hESCs. ESK transplantācija agrīnā embrijā tiek izmantota arī biotehnoloģijā lauksaimniecībā, kā arī eksperimentos ar gēnu terapiju.

Ģenētiski modificētu ESK pārstādīšana tiek izmantota, lai pārbaudītu mutāciju gēnu mērķa šūnas. In vitro kultivētās ESK tiek izmantotas biotehnoloģijā, lai radītu nokautas peles. Šim nolūkam, ar homologo rekombināciju tikt noņemts no ESP pētījums gēnu (nokauts) un selektīvie media izdalīt šūnas trūkst šo gēnu. Tad nokauts PGCs injicēt blastocistas vai veikt tos ar blastomeres morula apkopošanu. Iegūtos himēro agri embrijus transplantē adresātu sieviešu un jaundzimušā pelēm izvēlēts starp indivīdiem ar gametas, nullizigotnymi šo gēnu. Saskaņā ar šo tehnoloģiju, tiek izveidotas daudzas nojaukšanas peles līnijas, kuras plaši izmanto eksperimentālajā bioloģijā un eksperimentālajā medicīnā. Pie šiem bioloģiskajiem modeļiem pētīta vērtību konkrētu gēnu embrionālo attīstību, kā arī to lomu mehānismiem slimībām un patoloģiskiem nosacījumiem cilvēkiem. Turklāt jauno gēnu terapijas metožu preklīniskajā testēšanas fāzē tiek izmantotas nojaukšanas dzīvnieku līnijas. Piemēram, izmantojot gēnu transfekcijas kas ESK normālā alēle mutanta gēna pārvaldīt efektīvi labot mutāciju, streiki asinsrades sistēmu. Ārvalstu gēnu ievadīšana ESP ļauj ātri izveidot līnijas Homozigota transgēno laboratorijas dzīvniekiem. Tomēr jāatzīmē, ka tehnika vērsta krustmija gēns droši izstrādāts kā tomēr tikai salīdzinoši ESC pelēm. Izmantojot peļu ESP double knockout uzstādīta funkcionālā loma rajona klastera gēnu hromosomā 7 (kopiju genoma reģionā 19 minūtes cilvēka hromosomu), un proksimālo daļu no 11. Hromosomā (copy cilvēka 5d hromosomu) - dzēšanu šo gēnu ESK pelēm ļāva novērtēt cilvēku analogo funkciju.

Jaudas funkcija pētījumi cilvēka embrija gēnu, transfekcijas gēnu, kas laboratorijas dzīvniekus atļauts hESCs jo īpaši crypto precizēt lomu gēna cilnes un veido kardiogēns mesoderm, Pax-6 gēnu - in embrioģenēzes acīs. Veido pirmo izpausmi gēnu nenobrieduši proliferējošu karšu ESC teratokarcinomas un blastocistas pelēm apstiprināja milzīgs represijas ESK transsignalizatsii gēniem. Par mutanti, ESP 60-80 un 20-30 šūnu normālas pirms implantācijas peles embriju kombinācija noved pie attīstības himēro embriju kurā grāmatzīmes iestādes veido donorvalstīm un saņēmējvalstīm šūnas, kas ļauj mums, lai noteiktu lomu nezināmu gēnu gastrulation un organoģenēzes. Funkcionālā karte gēnu attīstīt peles embriju paplašināto informāciju par nozīmi gēnu SF-1 cilnes virsnieru dziedzera un dzimumorgānu primordia, WT-1 gēnu - nierēs cilnes myoD ģimenes gēni - cilnē skeleta muskuļu gēnu saimes gata-1-4 - ar ierobežojumu nobriešanas eritro- un limfopoēzes pamatnozares.

Režisors nost no mātes un aizgādības allēļu gēnu hESCs izmanto vektoru rekombinâzes kalpoja noskaidrot funkcijas dažādu gēnu agri embrioģenēzes un tehnoloģiju mērķtiecīga cilvēka nezināmu gēnu peles ESP veicina atklāt jaunu mutanti, gēnu, kas atbild par attīstību smagu iedzimtu slimību laikā. Izmantojot knockout metodi, kas definēta devēja nozīmi dažu gēnus, ar ko embrija audus: gata-4 - par infarktu, gata-1 - pie eritrocītu asinsrades audu, myoD - skeleta muskuļu, brachyury - par mesoderm ierobežojuma transcriptases hnf3 un hnf4 - par aknu cilmes šūnas, enkurskrūves-2 - grāmatzīmju klonu T un B limfocītu (Repina, 2001). Double dzēšana gēniem hESCs ir atvēris piekļuvi pētījumu par funkcionālās lomas gēni dīgļa slāņu, segmentācijas un homeosis un ESC transplantācijas noteiktā iespēja iegūt dzīvotspējīgu starpsugu hibrīdu embrijiem. Ar uzlabotām metodēm transplantācijas donoru PGCs vienā 8 šūnu embrija pierādīts, ka chimerization šūnu līmenī daudzu orgānu saņēmējas embriju. Ņemiet vērā, ka šūnu kāposti ir atrodamas cilvēka audu saņēmējs pelēm orgānu pēc ievadīšanas cilvēka asinsrades cilmes šūnu uz blastocistas. Tika konstatēts, ka peļu embriju veidošanās asins struktūru cirkulējošo pluripotentam hESCs laikā. Iespējams, ka viņu bioloģiskā funkcija ir nākotnes imūnsistēmas embrioniskajā organizācijā. Ar ESC in vitro reproducēt atbilstošus modeļus cilvēka ģenētisku slimību: double nokauts models dystrophin gēnu pelēm Dišēna muskuļu distrofijas, shutdown atm gēnu (vadības signāls sintēze kināzes hromatīna) - ataksija-teleangektaziyu. Šajā gadījumā fatāla iedzimta slimība bērniem defektu dēļ DNS remonta attīsta deģenerācija Purkinjē šūnu smadzenītēs, kas ir kopā ar involūcijas aizkrūtes dziedzera dēļ bojāeju proliferējošās šūnās. Klīnika, patofizioloģija un patomorfologija ataksija-teleangek- tazii atveidotas ar ievešanu ESC patoloģisku ģenētiskās informācijas no pelēm himeras atbilst tiem cilvēkiem. Turklāt ataksija-teleangektazii izmantojot PGCs un nokauts pelēm izstrādāts eksperimentālo modeli, daži iedzimtām homozigotajās cilvēka slimībām, kas saistītas ar traucējumiem ogļhidrātu un lipīdu metabolismu, katabolismu aminoskābes, aizvākšanu no vara un bilirubīnu, kas būtiski palielinot iespēju eksperimentālā medicīnā pirmsklīnisko pārbaudītu jaunas metodes, lai attiecīgās slimību ārstēšanai tiesības.

[12], [13], [14], [15]

Cilmes šūnu citohidrīda izmantošana

Hibrīda šūnas, ko izdala ar sapludinot somatiskās šūnas no hESCs, ir adekvāti un daudzsološs modelis pētīt cilmes šūnu pluripotency un pārplānošanu diferencētu šūnu hromosomu. Tsitogibridy iegūst, apvienojoties ESP ar diferencētu šūnu pieaugušo dzīvnieku, sniedz iespēju izpētīt saikni starp genomu dažāda "vecuma": izstrādā unikālu situāciju, kad homologu hromosomas, kas iegūti no šūnām dažādu posmu diferenciācijas, un dažādas pakāpes brieduma, ir tādā pašā kodolā, kur viņi var viegli transdeystvuyuschimi dalīties normatīvo signālus. Ir grūti paredzēt, kā reaģēs tsisregulyatornye epiģenētiska sistēma homologu hromosomas esošo YN laikā atšķirts attīstību, atbildot uz ietekmes transdeystvuyuschih signālus no embrija saistīto genomu. Turklāt ar hibrīda šūnās notiek nošķiršana vecāku hromosomas, kas ļauj pētīt mijiedarbību ar genomu pie atsevišķu hromosomu līmenī, proti, iespējams, noteiktu daļu specifisku hromosomu uzturēšanu pluripotency vai gluži pretēji - diferenciācijas rezultāts.

Kā pirmo eksperimentālo modeli pētot mijiedarbību genomu dažādu "attīstības vēsturē", ko izmanto tsitogibridy iegūta, apvienojot teratokartsinomnyh polipotentas un diferencētas somatiskās šūnas. Dažos gadījumos šādas hibrīda šūnas saglabāja pluripotentās īpašības pietiekami augstā līmenī. It īpaši, in vivo somatisko hibrīda teratokartsinomno-šūnas tika izraisīta attīstību true teratomas kas satur atvasinājumus visu trīs dzimumšūnu slāņus, in vitro in suspensiju kultūrām veidojas embryoid struktūras. Pat šāda veida starpsugu tsitogibridov atzīmēja klātbūtni augļa antigēnu gadījumos, kad somatisko partneris apvienošanās ar teratokarcinomas šūnām bija limfocīti vai thymocytes. Jāatzīmē, ka tsitogibridy pēc apvienošanas teratokartsinomnyh šūnām ar fibroblasti, kas ir saskaņā ar fenotipu fibroblasti.

Svarīgākais ir tas, ka ir konstatēts, ka in-teratokartsinomno somatiski hibrīda šūnas parādījās signs genoma pārplānošanu diferencētu šūnu, kas raksturīgs ar aktivizēšanas atsevišķu gēnu vai neaktīva X-hromosomu somatisko partneri. Tādējādi pētījumu par tipa tsitogibridah teratokartsinomno-somatiskās šūnas, rezultāti liecina, ka hibrīda šūnas bieži saglabāta pluripotency un pārplānošanu genoma, ir pazīmes somatisko partneri.

Eksperimentos iegūt embrionālās intraspecific hibrīda šūnas, sapludinot splenocytes ar peles ESP pieaugušo dzīvnieku pētīja īpašības, piemēram tsitogibridov, segregācija analīze vecāku hromosomas un novērtēja pluripotency hibrīda genomu. Attiecībā uz starpsugu hibrīdu šūnām, ko iegūst, sintēzes teratokarcinomas šūnām ar somatisko šūnu, parasti raksturīgs zems hromosomu atdalīšanai ar tetraploīdās vai tuvu-tetraploīdās kariotips. Citohidrīdā tika novērots līdzīgs hromosomu kompozīcija ar primāro dzimuma šūnu saplūšanu ar limfocītiem. Tajā pašā laikā, starpsugu hibrīda šūnas iegūtas, kā rezultātā apvienojoties peles limfocītu šūnu teratokartsinomnyh ūdeles, tur bija intensīva segregācija hromosomu somatisko partneri.

Kvalitatīvi jauns posms pētījumā segregācijas vecāku hromosomas starpsugu hibrīdiem nāca pēc izstrādes microsatellite analīzes metodi, izmantojot polimerāzes ķēdes reakciju, kur katrs peles hromosomu atrasts dažus simtus marķieri, kas ļauj droši atšķirt jebkuru pāri homologu hromosomu hibrīda šūnās.

Apvienojot Esko (izmantojot HM-1 šūnas, kurās trūkst gipoksantinfosforiboziltransferazy aktivitāti, 2n = 40, XY, izolēts no blastocysts peļu celma 129 / 01a) ar splenocytes no pelēm congenic līnijas DD / c izdevies iegūt kopumu hibrīdu klonu morfoloģiska bija līdzību ar hESCs. Visi kloni tika izolēts selektīvajā vidē, kurā augšana ir iespējama tikai ar aktīvo šūnu gipoksantinfosforiboziltransferazoy. Elektroforēzes analīze atklāja klātbūtni visu klonu allelic variants gipoksantinfosforiboziltransferazy raksturīgs mice DD / c. Izmantojot citoģenētiskus analīzi, tika konstatēts, ka četri bija trīs hibrīda kloni okolodiploidny noteikt hromosomu. One netālu-tetraploīds klons bija iekļauti divi populācijas hibrīdu šūnām, no kuriem viens bija tetraploīds, un otrais, mazāku - Diploīds.

Analysis of microsatellite ļautu diskriminēt jebkuru homologu hromosomas mouse 129 / 01a un DD / c pāri, hibrīdajā klonus ar okolodiploidnym kopumu parādīja, ka kloni notika divās atsevišķās preferenciālo eliminācijas autosomes somatisko partneri. Lielākā daļa autosomu kloni HESS2 un HESS3 bija marķieri rindā 129 / 01a, ti, pluripotentā partneris. Izņēmums bija hromosomu 1 un I: kloni HESS2 un HESS3, kopā ar marķieru HM-1 šūnām, nelielu skaitu marķieru klāt somatisko partneri. Šie rezultāti var atspoguļot nepilnīgu nošķiršanu hromosomu 1 un un somatisko partneri, un ir saskaņā ar citoģenētiskām datiem, trisomija hromosomu kas notiek 30-40% HESS2 un HESS3 šūnu klonus. HESS4 klons atšķīrās ievērojami hromosomu sastāvā: daudzi autosomes Šis klons cēlies no genoma ESK (hromosomās 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 un 17), bet hromosomas 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18 un 19 bija pārstāvēti abu vecāku homologi. Mikrosatelītu kvantitatīvais rādītājs, kas marķēja šos homologos hromosomus, bija aptuveni 1: 1. Tas ļāva autori, kas liecina, ka viens homolog ir atvasināts no genomā ESC un otrs - no diferencētām šūnām. Dažos subclones par klonu HESS4 novērota tikai simbolisku klātbūtni hromosomas 18. Un 19. Somatisko partneri. Rezultāti liecina, ka šūnas klonēt HESS4 papildus hromosomu atdalīšanai somatisko partnera, bija likvidēt viena vai abu analogiem no iepriekš hromosomu polipotentas genomu, ti, tur bija divpusēja nošķiršana hromosomu abu vecāku - parādība ir diezgan neparasts, jo tsitogibridov raksturīga nošķiršana hromosomu tikai viens no vecākiem.

Turklāt pēc 20. Fragments, visi kloni hibrīda šūnas satur tikai X hromosomas marķierus somatisko partneri, tas ir, kloni tika aizstāts X hromosomu ESC uz X hromosomā somatisko partneri. To apstiprina in situ hibridizācijas dati, izmantojot PITC marķētu zondi, kas raksturīga peles X-hromosomai: pozitīvs signāls tika konstatēts tikai vienā hromosomā. Jāatzīmē, ka agrākos audzēšanas posmos (līdz 15. Pārejai) saskaņā ar citoģenētiskajiem datiem daudzās šūnās bija divas X-hromosomas. Līdz ar to, izmantošana selektīvās nesēju ļauj manipulēt hromosomu sastāvu hibrīda šūnas un vērsta, lai atlasītu klonu pārvadā viens hromosomu somatiskās partneris ESP fona genomā.

Kā unikāla iezīme genoma tsitogibridov ir lokalizāciju vecāku genomu vienā kodolā, protams, rodas jautājums par uzturēšanu īpašības polipotentas embrija genoma ESC-somatisko šūnu hibrīdu apstākļos ciešā kontaktā ar genomā diferencētu šūnu. Morfoloģiski ESC citotoksis un somatiskās šūnas atgādināja ESC vecāku līniju. Kvalifikācija pluripotency parādīja, ka visi kloni okolodiploidnym noteikts no hromosomas varēja veidoties suspenzijas kultūru embryoid struktūru, kurā atvasinājumi trim dzimumšūnu slāņiem klāt.

Lielākajai daļai hibrīda šūnu bija ECMA-7 antigēns, kas bija agrīnu peles embriju raksturojošs marķieris, kā arī augsta sārmainās fosfatāzes aktivitāte. Visvairāk pārliecinošie dati par hibrīdu šūnu augstajām pluripotentām īpašībām tika iegūti eksperimentos, lai iegūtu injekciju kimeru sēriju, kurā ietilpst klāsta HESS2 hibrīdās šūnas. Bioķīmisko marķieru analīze parādīja, ka donoru hibrīdu šūnu pēcnācēji tika konstatēti lielākajā daļā kimēru audu. Tādēļ hibrīdu šūnas, kas iegūtas, sajaucot ESK un somatiski diferencētās šūnas, saglabā pluripotenci augstā līmenī, ieskaitot spēju veidot himeras, kad tās ievieto blastocītu dobumā.

Klonu HESS2 un HESS4 ievērojami atšķiras vecāku hromosomu sastāvā, bet tiem bija līdzīgas pluripotences īpašības. Varētu pieņemt, ka plyuripotentnostv "hibrīda genomā izpaužas kā dominējošā zīmi, bet tas ir iespējams, ka ne visi embrionālo genoma hromosomas ir iesaistīti uzturēšanu pluripotency. Ja šis pieņēmums ir taisnība, var sagaidīt, ka novēršana dažu hromosomu pluripotentā partneru no genoma hibrīda šūnām nav pievienots izmaiņas savā polipotentas statusu. Šajā gadījumā, analīze segregācijas vecāku hromosomu embrija hibrīda šūnās ļautu pietuvinātos identificētu hromosomas, kas atbild par kontroli pluripotency embriju šūnas.

Serov O. Et al (2001) atrasts starp 50 pēcnācējiem iegūta, krustojot ar himēru ar normālu pelēm, tiem, kas varētu būt genotips pelēm 129 / 01a, un uz kuras izvietoti X hromosomu DD pelēm. Autori redz iemeslu tam, ka samazinās pluripotenci hibrīda šūnās somatiskā genoma ietekmē. Alternatīva izskaidrojums varētu būt negatīva ietekme trisomiju kādu nelīdzsvarotība autosomes un seksa hromosomas (XXY novērota šūnu līdz 15. Fragments) hibrīdajā šūnās pagājušo meiosis. Ir zināms, ka XXY šūnas nevar šķērsot mejozi un veidot gametas. Trisomija ir spējīgs izraisīt samazinātu proliferatīvu aktivitātes hibrīdu šūnas, kā rezultātā selektīvas priekšrocības attīstībā himēru var būt no šūnām saņēmējas embriju. No tā izriet, ka, lai adekvāti novērtētu hibrīdu šūnu pluripotentu potenciālu, ir nepieciešams iegūt hibrīdu klonus ar normālu diploīdu hromosomu komplektu.

Eksperimentos Serova O. Et al (2001) pirmais demonstrēja pārplānošanas iespēju X hromosomu genomā ar somatisko šūnu hibrīda šūnā. Šis secinājums izriet no autori analizē ekspresiju himēru HPRT gēna (X-hromosomu marķieris): klātbūtne allelic variants HPRT DD / c pelēm tika konstatēts visās analizētajiem himēriska audos. Jāuzsver, ka pēc tam, kad hibrīdu šūnu blastocistas dobumā tsitogibridy ietilpst neselektīvajā nosacījumu ieviešanu un saglabāšanai X hromosomu genomā hibrīdu šūnu nozīmē, ka tā ir kļuvusi obligāta, komponents tās genomā un nav diskriminējoša to no Y hromosomas pluripotentam partneri.

Apkopojot somatisko un pluripotenču genomu mijiedarbības analīzes rezultātus hibrīdu embriju šūnās, autori secina, ka dažos citohīrusos pluripotence izpaužas kā dominējošā iezīme. Hibrīda genoms spēj pārprogrammēt atsevišķas diferencētu šūnu hromosomas, kas tomēr neizslēdz somatiskā genoma reverso efektu uz embrionālā genoma pluripotenci. Hibrīdo šūnu audzēšanā diferenciācijas indukcija notiek daudz biežāk nekā ESK NM-1 oriģinālajā vecākajā līnijā. Līdzīgs efekts tiek novērots primāro koloniju veidošanā: daudzas primārās embriju hibrīdu šūnu kolonijas veidojas agrīnās attīstības stadijās ar lieliem klonu zudumiem to selekcijas un reizināšanas laikā.

Tādējādi, tsitogibridy apvienošanās ESC ar somatiskajām šūnām, neraugoties uz ciešā kontaktā ar genomā diferencētu šūnu saglabā pluripotency kā unikālu iezīmi embrija genoma. Turklāt šajās hibrīdu šūnās ir iespējams pārprogrammēt atsevišķas hromosomas, kas rodas no difūzām šūnām. Tas joprojām nav skaidrs, cik labi saglabājušās plyu- ripotentnye īpašības embrija genoma hibrīda šūnās, it īpaši to spēju piedalīties veidošanā dīglis līniju himeras. Šim nolūkam ir nepieciešams iegūt embriju hibrīdu šūnas ar normālu kariotipu. Jebkurā gadījumā pluripotentam embrionālās hibrīda šūnas var būt reāls modelis ģenētiskās identifikācijas iesaistīto uzturēšanu pluripotency vai viņas kontrolē kā divpusējs nošķiršana vecāku hromosomu potenciāli sniedz šādu iespēju hromosomas.

Ne mazāk pievilcīgs ir fenomena izpēte, kuru O. Serovs un līdzautori (2001) definē kā "hromosomu atmiņu". In hibrīda genomā homologiem hromosomas ir divas alternatīvas konfigurācijas: homologus somatisko partneris reizi veikta diferenciācijas, bet analogi polipotentas partneris, šis process ir tikai sākums. Tādējādi, saglabājot augstus polipotentas īpašības hibrīda šūnas, norāda, ka "pluripotentam" konfigurācijas homologi ESC diezgan stabils hibrīda genomu, neskatoties uz to ietekmi transdeystvuyuschih faktoru, kas nāk no somatisko partnera. Iepriekš aprakstītās iezīmes pārplānot atšķirt homologu genoma hromosomu attīstības himeras laikā neizslēdz iespēju, ka pirmie posmi veidošanās vitro un kultivējot tsitogibridov viņi saglabā savu statusu diferenciācija vivo apgūtās. Saskaņā ar jaunākajiem datiem, kad nododot embrionālās hibrīda šūnas neselektīvajā vidē, kurā notiek intensīva novēršanas hromosomas tikai somatisko partneris, t.i., genoma hibrīda šūnu viegli diskriminē analogiem pēc in vitro kultūrā 10-15 fragmenti. Tādējādi, embriju hibrīda šūnas veido daudzsološu eksperimentālu modeli pētījumu ne tikai par fundamentālo īpašību embrija genoma kā pluripotency, bet arī savas alternatīvas - embrija diferenciāciju.

Embrionālo cilmes šūnu transplantācijas terapeitiskā iedarbība

Pirms analizēt terapeitisko efektivitāti ESC transplantācijas un to atvasinājumus apkopot minēto materiālu. Funkcijas ESC ziņā pilnībā īstenot embrioģenēzes in vitro ir nepietiekams, jo defektu šajā gadījumā dēļ nav mezenhīmu cilmes šūnām, kas notiek organismā autonomi un neatkarīgi no hESCs. Ģenētiskā potences ESK mazāk ģenētisko potenciālu zygotes tāpēc tieši klonēšanu embriju ESP neizmanto. Unikālo bioloģiskā potenciāls hESCs kā vienīgā šūnas, kurās attīstības programmas tiek izvieto pilnīgi konsekventu īstenošanu, konstatē pieteikumu pētījumā gēnu funkciju pētījumiem. Izmantojot Esko veikts dekodēšanas pirmais signāls, kombinācijas, kas aktivizē ekspresiju sākumā un beigās gēnu, kas kodē attīstībai trīs cilmes slāņiem. Saglabājot genoma pluripotency ESP in vitro padara tos unikāls rīku remontam reģenerācijai, kas var automātiski kompensētu šūnu zaudējumiem bojātas orgānus un audus. Ideālā hipotētiskā iemiesojumu var pieņemt, ka "... Ar transplantācijas donoru PGCs ar recipienta organisma tiek nodotas kompakti iepakotas programmas, kas labvēlīgos apstākļos realizē būvniecībā jaunu tkani'7 spēj" ... Efektīvi integrēti saņēmēja ķermeni kā morfoloģiskā, gan funkcionāla, gan funkcionāla. "

Protams, pēc tam izstrādājot paņēmienus monodifferentsirovki ESK sāka pētīt in vivo funkcionālo aktivitāti šūnu iegūti in vitro no vienas specializētās klons. ESP proliferāciju klona iedzīvotāju rada migrācijas cilmes šūnas, kas faktiski var aktīvi iekļaut saņēmējs audu bojājumu zonas, kas tiek izmantota reģeneratīvās medicīnas un plastmasas. Ir konstatēts, ka Dopa neironu transplantācija substantia nigra samazina eksperimentālās hemiparkinsonijas klīniskās izpausmes. Donoru nieru cilmes šūnu reģionālās transplantācijas samazina mehānisko traucējumu pakāpi, ko izraisa mugurkaula un smadzeņu trauma vai kontūzijas. Saņemtie un pirmie pozitīvie cilmes šūnu transplantācijas rezultāti demielinizējošajās slimībās. Šķiet, ka ESK reģeneratīvās plastmasas spējas paver neierobežotas iespējas izmantot šūnu transplantāciju praktiskajā medicīnā. Tomēr, pārstādot ārpusākās zonās, ESK neizbēgami pārvēršas par audzējiem. Ja ESK subkutāni injicē imūndeficīta pelēm, teratomas tiek veidotas. Kad pārstādīt zem kapsula vircas ESK sēklinieka in singēnās pelēm arī veido teratomas sastāv no dažādiem audiem, šūnām, kas ir atvasinājumi, visu trīs dzimumšūnu slāņiem. Šādos teratomos samazinātas organogenezes procesi ir ārkārtīgi reti.

Vairāki darbi sniedz informāciju par ESCO agrīnu atvasinājumu transplantācijas pozitīvajiem rezultātiem dzīvniekiem ar eksperimenta patoloģiju. Cell neurotransplantation izmantojot atvasinājumus PGCs tiek tālāk izstrādāts eksperimenta un pirmās klīniskajos pētījumos par korekcijas funkcionālo traucējumu galvas un muguras smadzeņu traumas, ārstēšanai syringomyelia un multiplās sklerozes (Repina, 2001). Ar Advent tehnoloģijas neyronogeneza ESP in vitro, tā vietā, lai izmantotu embrija smadzeņu audu pārstādīšanas metodes, kas izstrādātas atvasinājumus neurospheres, kas iegūti no kultūrām embrija nervu audos. Šādas transplantācijas suspensijas ir daudz viendabīgākas un satur neironu un neiroglia prekursorus.

Papildus regulāri barotnē ar retīnskābi devā 10 ug / ml uz 6 nedēļām embrija līnijas (teratomas) NTERA-2 cilvēka -kartsinomy izveidots vairāk nekā 80% no post-mitozes neironiem. Pilnīgs viendabība neironu populācijas tiek sasniegta ar plūsmas šķirošanas apzīmētas immunophenotypic marķieru nobriedušo neironiem, kas var atbrīvoties no atliekām teratokartsinomnyh un nenobriedušām šūnām. Pēc transplantācijas dažādos reģionos smadzeņu eksperimentālo dzīvnieku šie neironi ir ne tikai izdzīvot, bet arī iestrādāta reģionālajās neironu tīkliem. Dzīvniekiem ar eksperimentāliem modeļos lokāliem defektiem, CNS neurotransplantation samazina klīniskās izpausmes cilvēka patoloģijas, piemēram, ietekmi galvaskausa un smadzeņu trauma, trieka, demielinizējošu slimību, iedzimtu smadzenīšu attīstības defektiem, slimībām uzklājot lipīdu un polisaharīdiem.

Lai optimizētu reģenerācijas procesus centrālās nervu sistēmas deģeneratīvās slimībās, tiek izstrādātas tehnoloģijas, kas paredzētas mielīna ražošanas oligodendrokītu sagatavošanai no ESK. Pirmais posms tradicionāli ietver ESK izplatīšanos, palielinot transplantācijai nepieciešamo šūnu skaitu. Otrajā posmā tiek veikta šūnu virzīta diferenciācija mielīna ražojošo oligodendrokītu prekursoru populācijā, ko kontrolē selektīvie marķieru antigēni.

Daži perspektīvas tiek atvērta apkalpot atvasinājumu ESP, lai izstrādātu metodes korekcijai imūndeficīta ko izraisa ģenētisko defektiem nobriešanas aizkrūts dziedzera. Pētījumos ar nokauts (rag 1) pelēm ar inducētu gēnu defektu - pārkāpšana rekombinācijas mehānisms V (D) J gēns loci TCR, kas noved pie funkciju zudumu T-limfocītu, transplantācijas agrīnās atvasinājumi PGCs in aizkrūts dzīvnieka atgūst nobriešanu parastos populāciju imūno kloniem, kas atbildīgas par šūnu imunitāte. Klīniskie pētījumi par transplantācijas iepriekš sagatavoti in vitro hESCs lai ārstētu letālu iedzimta anēmiju bērniem.

Iebildumus pret strauju cilmes šūnu transplantācijas ieviešanu klīnikā pamato ierobežots skaits cilvēka embriju cilmes šūnu stabila līnijas un to standartizācijas nepieciešamība. Lai paaugstinātu standartizēto ESC līniju, kā arī pieaugušo cilmes šūnu tīrību, tiek piedāvāta līniju atlases metode, pamatojoties uz molekulārās ģenētiskās analīzes rezultātiem par īsu atkārtotu DNS dubultošanos. Tāpat ir nepieciešams pārbaudīt ESC līnijas par nelielu hromosomu pārkārtošanu un ģenētiskas mutācijas, jo to iespējamā iespējamība šūnu audzēšanas apstākļos ir pietiekami augsta. Darbs paplašina obligāto īpašību testēšanas visu PGCs un reģionālās pluripotentām cilmes šūnu tipiem, jo to pavairošana in vitro, var radīt jaunus parametriem nav raksturīgi embrionālās cilmes šūnas, lai galīgi vai audos. Jo īpaši, tas ir pieņemts, ka ilgtermiņa audzēšana medijos ar citokīniem Hess tuvāk audzēja šūnām, jo tie notiek līdzīgas izmaiņas ceļus, kas regulē šūnu cikls ar par spēju īstenot neierobežotu skaitu šūnu dalīšanās iegādi. Daži autori, pamatojoties uz audzēju attīstības potenciālu, uzskata cilvēku embriju cilmes šūnu agrīnu atvasinājumu kā neuzmanības cilvēka transplantāciju. Viņuprāt, ir daudz drošāk izmantot ESK pēctečus, proti, diferencētu šūnu priekštečus. Tomēr ticams paņēmiens stabilu cilvēka šūnu līniju iegūšanai, kas atšķiras pareizajā virzienā, vēl nav izstrādāts.

Tādējādi literatūrā ir vairāk un vairāk datu par cilvēka embriju cilmes šūnu atvasinājumu transplantācijas pozitīvo terapeitisko efektu. Tomēr daudzi no šiem darbiem tiek pārskatīti un kritizēti. Daži pētnieki uzskata, ka agrīnu klīnisko pētījumu rezultāti ir sākotnēji raksturīgi un liecina tikai par to, ka cilmes šūnas var labvēlīgi ietekmēt slimības klīnisko gaitu. Tādēļ ir nepieciešams iegūt datus par šūnu transplantācijas ilgtermiņa rezultātiem. Kā argumentu, tiek sniegti klīniskās neirotransplantācijas attīstības stadijas. Patiešām, literatūrā, sākotnēji dominē publicēšanas augstu efektivitātes smadzeņu transplantācija, fragmentiem embrijiem Parkinsona slimības, bet tad sāka parādīties ziņojumi noliegt terapeitisko efektivitāti embrionālo vai augļa nervu audiem pārstādīt smadzenes pacientu.

Veica pirmo klīnisko izpēti drošības novērtēšanas transplantācijas neuroblast - atvasinājumus PGCs NTERA-2 teratokarcinomas, nenobriedušas šūnas, kas savairojušies kultūrā tika pakļauti glabāšana 100 miljono šūnu masas. Daļa no šādi iegūtā šūnas tika izmantota, lai noteiktu īpašības šūnu fenotipa un netīrumiem, kā arī, lai pārbaudītu iespējamo piesārņojumu ar vīrusiem un baktērijām. No barotnes tika izņemta LIF un padeves slāņa audu šūnās un augļa radīti apstākļi, kas vērsti diferenciācijas hESCs stājas neuroblasts ar kombināciju citokīnu un augšanas faktoru. Tad neuroblasti tika attīrīti no nenobriedušām teratokarcinomu šūnām plūsmas urbuma šķirošanā. Pēc otrās attīrīšanas un raksturojumu fenotipu transplantēto šūnu neuroblasts (10-12 miljoniem) suspensija, izmantojot speciālu šļirci un mikrokanulas stereotaxy un kontrolē CT ievadīts kodola basalis smadzeņu pacientu (septītā mēneša pēc hemorāģisko insultu). Odnogodovoy pēctransplantācijas skrīninga ietekmi transplantācijas neironiem taktu zonā netika konstatēta negatīva un nevēlamus efektus. Pusei pacientu novēroja dzimumtieksmes uzlabošanos periodā no 6 līdz 12 mēnešiem pēc transplantācijas. Pozitīvie klīnisko izmaiņas tika pievienots in asiņu piegādes stroke zonā pieaugumu pēc transplantācijas šūnu: vidējais absorbcijas palielināšanos fluorescences iezīmēta 2-deoxyglucose, atbilstoši pozitronu emisijas tomogrāfijas sasniedza 18%, un dažiem pacientiem - 35%.

Tomēr ASV Nacionālais veselības institūts veica neatkarīgu pētījumu par neirotransplantācijas klīnisko efektivitāti pacientiem ar Parkinsona slimību. Pacienti pirmajā grupā tika pārstādītas ar embrionālajiem nervu audiem, kas ražoja dopamīnu, bet otrai pacientu grupai tika veikta nepatiesa operācija. Rezultāti norāda uz šādu nieru transplantācijas nulles klīnisko efektivitāti, neskatoties uz to, ka dopamīna veidojošie embriju neironi izdzīvoja saņēmēju smadzenēs. Turklāt, pēc 2 gadiem pēc transplantācijas augļa nervu audiem, kas 15% pacientu izstrādājusi pastāvīgu diskinēzija, kas trūkst pacientu placebo grupā (Cilmes šūnas: zinātnisko progresu un turpmākās pētniecības virzieni Nat inst, no Veselības ASV ...). Turpmāk tiek novēroti slimības tālākā attīstība šiem pacientiem.

Daži autori atribūts pretrunu literatūru par novērtēšanu klīnisko efektivitāti Neurotransplantation datus ar atšķirīgu pieeju atlases pacientu grupu, neatbilstoša izvēle objektīvām metodēm, lai novērtētu to stāvokli un, pats galvenais, dažādi noteikumi attīstības augļa nervu audiem un dažādās smadzeņu daļās, no kurām audums tika ražoti dažādos izmēros operācijas transplantācijas un metodiskās pazīmes.

Jāatzīmē, ka mēģinājumi virzīt transplantāciju pluripotento embrija cilmes šūnu striatālu reģionā smadzeņu žurkām ar eksperimentālo ķermeņa gemiparkinsonizmom pievieno ESC proliferāciju un to diferenciācijas vērā dopamīnerģisko neironiem. Ir jāpieņem, ka jaunizveidotie neironi efektīvi iebūvēts neironu tīklu, jo ESP pēc transplantācijas tika novērota korekcija anomālijām uzvedības un motora asimetrijas apomorfīna testu. Tajā pašā laikā daži dzīvnieki nomira sakarā ar transplantēta ESK transformāciju smadzeņu audzē.

Eksperti no ASV Nacionālās un Medicīnas akadēmijas speciālisti National Institutes of Health uzskata, ka klīniskā potenciāls hESCs pelnījusi nopietnu uzmanību, tomēr uzstāt par nepieciešamību detalizētu pētījumu par to īpašībām, varbūtība komplikāciju un ilgtermiņa ietekmi eksperimentos ar atbilstošu bioloģisko modeļiem cilvēka slimību (Cilmes šūnas un Nākotnes reģeneratīvās medicīnas Nacionālās akadēmijas prese, cilmes šūnas un nākotnes pētījumu virzieni., Nat. Inst, Veselības ASV).

No šī viedokļa, ir svarīgi, ka salīdzinošā histoloģiskai analīzei eksperimentālās teratoma iegūta, transplantācijas sēklinieka vircas PGCs ar teratomas, kas ir izstrādātas, pateicoties transplantācijas agrīno embriju, kas ietvēra arī klāt ESC parādīja, ka ESK neatkarīgi no to izcelsmes vai mijiedarbību ar Tās vai citas apkārtējās šūnas tādā pašā veidā realizē savu tumorigenic potenci. Tas pierādīts, ka šādi teratomas ir klonu izcelsmi, kā no audzējs ESP var notikt, kas sastāv no atvasinājumiem visu trīs dzimumšūnu slāņiem (.Rega, 2001). Jāatzīmē, ka tad, kad transplantē imūndeficīts pelēm klonētiem PGCs ar normālu kariotips un veido teratomas sastāv no dažādu veidu diferencēto somatisko šūnu. Šie eksperimentālie dati ir ideāls pierādījums teratomas klonālai izcelsmei. Raugoties no attīstības bioloģijā, tie liecina, ka tas nav vairāku izdarīto cilmes šūnu un pluripotentam cilmes šūnu identitāti, ir avots diferencēto atvasinājumu visu triju dzimumšūnām slāņiem, teratoma sastāvdaļas. Tomēr praktisko šūnu transplantācijas rezultāti šajos pētījumos, ir, ja ne pārmērīgi, tad brīdinājuma zīme potenciālo draudu, jo inficēšanās ESC vai aizmetņu cilmes šūnām dažādos audos pieaugušo imūndeficīts pelēm neizbēgami izraisa audzēju rašanos no transplantēto cilmes šūnām. Neoplastiskas deģenerācija ectopically pārstādīti ESC kopā ar parādīšanos satelīta populācijām diferencētu šūnu - par daļēji diferencēt noteikti ESP un cilmes kloni veltīta līnijas. Tas ir interesanti, ka transplantācijas hESCs skeleta muskuļu šūnās tuvumā teratokartsinomnymi neironi veido biežāk. Tomēr, kas administrē PGCs Mace ola vai blastocistas pievieno pilnīgai integrācijai cilmes šūnu bez veidošanās audzēja šūnu. Šajā gadījumā ESK ir iebūvēti praktiski visos embrija orgānos un audos, ieskaitot seksuālo rudimentu. Šādus allofennye dzīvnieki, pakļaujot teratokarcinomas šūnu 129 sākumposmā embrijiem 8-100 šūnas pirmo reizi tika sagatavoti. Jo allofennyh pelēm iedzīvotāju geterogenomnyh šūnu atvasināti donoru PGCs ieved kaulu smadzenēs, zarnu, ādas, aknu un dzimumorgānu, kas ļauj jums izveidot eksperimentā pat starpsugu šūnu himeras. Jo mazāks laiks agrīno embriju, jo lielāks procents no šūnu chimerization, augstāko grādu chimerization novērota asinsrades sistēmu, ādu, nervu sistēma, aknas un tievo zarnu allofennogo embriju. In pieaugušo organisma audu grozāmi chimerization aizsargā no saskares ar imūnsistēmas uzņemošo gistogematicalkie barjeras: transplantāciju, pirmatnējs dzimumšūnas ar sēklinieka parenhīmā kopā ar ievietošanu donors cilmes šūnu uz saņēmējs audu germenativny slāni. Tomēr ESC transplantācija pārnes blastocistas veidošanās chimeric primordia ģenitāliju ar paaudzes donoru pirmatnējs cilmes šūnu nenotiek. ESC pluripotency veidojot īpašiem nosacījumiem, un to var izmantot, lai klonēšanu: ESC transplantācijas pelēm 8-16-cell pele embriju, šūnu mitozi kur tsitokalazinom bloķētā, veicina normālu embryogenesis ar attīstību embriju donoru PGCs.

Līdz ar to, alternatīva ir transplantācija alogēnas ESC terapeitiskās klonēšanas balstās uz somatisko šūnu kodola pārstādīšanas stājas enucleated olšūnu, lai izveidotu Blastocistas iekšējo šūnu masu, no kuras pēc tam tiek piešķirta līnija ģenētiski identisku donoru PGCs somatisko kodola. Tehniski, šī ideja ir iespējams, jo iespēju radīšanu cilvēka embriju cilmes šūnu līniju no blastocysts iegūti pēc transplantācijas somatisko kodolus izņēma olšūnu vairākkārt pierādījis, eksperimentos ar laboratorijas dzīvniekiem (Nagy, 1990; Munsie, 2000). It īpaši pelēm homozigotas par mutāciju rag2, fibroblasti, ko iegūst, kultivējot subepidermal audu šūnas tika izmantoti kā donoru kodolus pārstādīti enucleated olšūnas. Pēc aktivizēšanas olšūnas "zigota" kultivētas līdz blastocistas veidošanos, no iekšējās šūnu masas ir izolētas PGCs un iet tos līniju, lai mutanta gēna nullizigotnyh šūnām (rag2 ~ / ~). Ar homologu rekombināciju šādās ESK, koriģēja viena alēla gēna mutāciju. Pirmajā eksperimentu sērija no hESCs rekombinantais gēns atgūti embryoid struktūras tika sagatavota, transfektèta šūnas sâls ar rekombinanto retrovīrusa (HoxB4i / GFP) un pēc pavairošanas pelēm injicē vēnu rag2 ~ / ~. Otrajā sērijā tetraploīdie blastomeri tika apkopoti ar ģenētiski modificētām ESK un pārstādītas sievietēm. Dzimušās imūnkompetences pelēm kalpoja kā kaulu smadzeņu donoriem, kas paredzēti transplantācijai mutantu peļņās, rag2 ~ / ~. Gan sērijā rezultāts bija pozitīvs: 3-4 nedēļas visās pelēm normālas nobriedušu mieloīdo un limfoīdo šūnu ir konstatēts, spēj radīt imūnglobulīns. Tādējādi, transplantācija vērā olšūna kodolos somatisko šūnu var izmantot ne tikai, lai ražotu embriju cilmes šūnu līnijas, bet arī par tsitogenoterapii - korekcija iedzimtu anomāliju, izmantojot ESC kā vektors transportēšanai labo ģenētisko informāciju. Bet šajā šūnu transplantācijas virzienā, bez bioētikas problēmām, ir arī ierobežojumi. Nav skaidrs, cik drošas transplantācija būtu terapeitiski klonēta šūnas ar genotipu identisks genotipu konkrētam pacientam, jo šādas šūnas var ieviest mutācijas, kas rada noslieci uz noteiktām slimībām. Normālu cilvēku olas paliek nepieejami objekts, bet arī tad, kad pārstādīt somatiskās kodolus izņēma dzīvnieku olšūnu tikai 15-25% inženierijas "zigota" izveidot līdz blastocistas stadijā. Līdz ar to nav definēts, cik blastocysts vajadzīgi, lai iegūtu vienu rindiņu polipotentas klonēti hESCs. Jāatzīmē arī augsta līmeņa finansiālās izmaksas, kas saistītas ar terapeitiskās klonēšanas metodoloģijas sarežģītību.

Noslēgumā in ESC pluripotency genomā hypomethylated DNS ir apvienota ar augstu telomerase aktivitāti un īsā C ^ šūnas cikla fāzes, kas nodrošina intensīvu un potenciāli bezgalīgu vairošanos, kuras laikā PGCs paturēt Diploīds hromosomas un "jauniešu" kopumu fenotips. Klonu pieaugums PGCs kultūrā neizslēdz tos atšķirt jebkurā specializētā šūnā organisma pie stop līnijas šūnu proliferāciju un pievienojot piemērotus regulēšanas signāli. Ierobežojums diferenciācijai hESCs in line in vitro somatisko šūnu tiek realizēta bez līdzdalību mesenchyme, apejot Nohteyaov, ir Organoģenēzes un bez veidošanās embrija. ESK ārpusdzemdību ievadīšana in vivo neizbēgami noved pie teratokarcinomas veidošanās. ESC transplantācija uz Blastocistas vai agrā embrija kopā ar to integrācijai ar audiem embrija un stabiliem chimerization struktūru.

Reģeneratīvā un plastmasas tehnoloģijas, kas balstās uz šūnu transplantācija ir krustpunkts interešu locekļu šūnu bioloģijas, attīstības bioloģijā, eksperimentālo ģenētika, imunoloģija, neiroloģija, kardioloģija, hematoloģijas un daudzās citās jomās, eksperimentālās un praktisko medicīnu. Svarīgākie eksperimentālie rezultāti apliecina iespēju pārprogrammējot cilmes šūnas ar virzienu maiņu to īpašībām, kas paver iespējas, lai kontrolētu cytodifferentiation procesus ar augšanas faktoriem - miokarda reģenerāciju, atjaunošanu CNS bojājumu un normalizēšanai saliņu aparātā aizkuņģa dziedzera. Tomēr plaši ieviest transplantācija atvasinājumi ESC medicīnas praksē, ir nepieciešams pētīt īpašības cilvēka cilmes šūnu, kas sīkāk un turpmākus eksperimentus ar PGCs kas eksperimentāliem modeļiem slimībām.

Bioētikas jautājumiem un problēma noraidījumu alogēnas šūnu transplantācijas varētu atrisināt novēroto plastiskums genoma reģionālo pieaugušo cilmes šūnām. Tomēr sākotnējā informācija ir tāda, ka tad, kad pārstādīt aknās izolēts un rūpīgi raksturīga autologas hemopoētisko šūnas, kuru ir jauni hepatocīti, iestrādājot aknu lobules, tiek pašlaik pārskata un kritizēta. Tomēr, publicēts datus, ka transplantācija neironu cilmes šūnas aizkrūts dziedzeris ir veidošanās jaunu asni no donoru T-un B-limfocītu, un pārstādīt nervu cilmes šūnas smadzeņu kaulu smadzenēs, noved pie veidošanos hematopoētisko dīgļu ilgstošs donoru mieloleikozes un eritropoēzi . Līdz ar to, pieaugušiem orgāni var tikt saglabāta polipotentas cilmes šūnas, kas spēj genoma pārplānošanu ESC uz jaudu.

Cilvēka embrijs joprojām ir ESK saņemšanas medicīniskiem nolūkiem avots, kas nosaka, ka jaunā morālās, ētiskās, morālās, juridiskās un reliģiskās problēmas krustpunkta nenovēršamība ir cilvēka dzīves laikā. ESP atklāšana deva spēcīgu impulsu neatlaidīgām diskusijām par to, kur atrodas robeža starp dzīvajām šūnām un vielu, būtību un personību. Tajā pašā laikā nav universālu normu, noteikumu un likumu par ESK lietošanu medicīnā, neskatoties uz atkārtotiem mēģinājumiem tos izveidot un pieņemt. Katra valsts savā tiesību aktā šo problēmu risina pati. Savukārt ārsti no visas pasaules turpina mēģināt attīstīt reģeneratīvās plastmasas medicīnu pēc tādām diskusijām, galvenokārt izmantojot ne-embrionālās cilmes šūnas un pieaugušu organismu cilmes šūnu rezerves.

Daži no embriju cilmes šūnu izolēšanas vēstures

Terato- (embrija) šūnas tika izolētas no -kartsinomnye spontāni notiek sēklinieku teratomas peļu celma 129 / ter-Sv, spontāna olnīcu teratomas peļu līnijas Lt / Sv, un no teratomas, ektopichno avots tika transplantēto šūnas vai embrija audos. Starp tādā veidā iegūto terato- stabiliem peļu līnijās (embrija) -kartsinomnyh dažos šūnas ir pluripotentā, citi tika pakļauti diferenciāciju tikai šūnās viena konkrēta veida, un daži ir parasti nespēj cytodifferentiation.

Tajā laikā, galvenā uzmanība tika pētījumu, kas liecināja par iespējamu atgriešanās terato- (embrijam) -kartsinomnyh šūnu normālu fenotipu pēc to ieviešanas embrija attīstības audiem, kā arī darbu, lai izveidotu uz in vitro ģenētiski modificētu terato- (embrijam) -kartsinomnyh šūnām, ar kuras palīdzību tika iegūtas mutācijas pelēm cilvēka iedzimtas patoloģijas bioloģiskajai modelēšanai.

Terato-embriju-karcinomas šūnu līniju izolēšanai tika izmantota kondicionēta suspensijas audzēšana. Jo kultūra terato- (embrijam) -kartsinomnye šūnās, piemēram, ESP, aug veidot embryoid iestādes, un pieprasīt, lai pārtulkot līniju saistošu disociāciju saglabājot pluripotency apgādes slāni embrionālo fibroblastu vai apturēšanas kultivēšanas vēdināmā medijos. Terato- pluripotentam celis (embriju) - carcinoma līnijas liels, sfērisku, ir augsta aktivitāte sārmainās fosfatāzes, veidlapu pildvielu un spēj vairākvirzienu diferenciāciju. Kad tiek ievadīts Blastocistas tiek summēti ar morulae, kā rezultātā veidojas himēro embriju, dažādos orgānos un audos, kas atvasinājumi ir atrodami terato- (embrija) -kartsinomnyh šūnas. Tomēr lielākā daļa šādu Himērisko embriju mirst dzemdē, un orgānu pārdzīvojušo himeras jaundzimušo ārvalstu šūnas un reti konstatētas ar mazu blīvumu. Tajā pašā laikā audzēju (fibrosarkomas, rabdomiosarkoma, un cita veida ļaundabīgo pietūkums un adenomas Aizkuņģa dziedzeris) strauji palielinās, un audzēja deģenerācija nereti notiek pat dzemdē himērisko embrijiem.

Lielākā daļa terato-embriju-karcinomas šūnu normālas embrionālo šūnu mikro vidē dabiski iegūst ļaundabīgas neoplastiskās īpašības. Tiek uzskatīts, ka neatgriezenisks ļaundabīgs audzējs ir saistīts ar proto-onkogēnu aktivizēšanu strukturālo pārkārtošanās procesā. Viens izņēmums ir šūnu līnijas embriokartsinomnoy SST3, teratoma, kas iegūts no peļu sēklinieka (line 129 / Sv-ter), kas uzrāda augstu spēju iekļauties audu un orgānu auglim bez sekojošā veidošanās audzēju himēro pelēm. Terito-embriju-karcinomas atvasinājumi šūnu līnijās ar chimera pelēm praktiski nepiedalās primāro gonocītu veidošanā. Protams, tas ir savienots ar augstfrekvences hromosomu aberāciju kopīgi lielākajai daļai terato- (embrija) -kartsinomnyh līnijām, kad šūnas novērotas kā Aneiploīdijas vai hromosomu anomālija.

Vairāki stabili terato- līnijas (embriju) -kartsinomnyh cilvēka šūna tika sagatavota saskaņā ar laboratorijas apstākļos, kas atšķiras ar pluripotency, augstu proliferatīva aktivitāte un spēja atšķirt kultūras augšanas laikā. Jo īpaši cilvēka terato-embriju-karcinomas šūnu NTERA-2 līnija tika izmantota, lai pētītu neirālās citodiferenciācijas mehānismus. Pēc šīs līnijas šūnu transplantācijas jaundzimušo žurku priekšējā vēdera subventrikulārajā rajonā tika novērota to migrācija un neironogeneze. Ir bijuši pat mēģinājumi transplantācijas neironos terato-, ko iegūst, kultivējot celis (embriju) -kartsinomnoy līniju NTERA-2, pacientiem ar insultu, kas, saskaņā ar autoru, kas ved uz klīnisko uzlabošanos slimības. Šajā gadījumā netika novēroti terato-embriju-karcinomas līnijas NTERA-2 transplantēto šūnu ļaundabīgi audzēji pacientiem ar insultu.

Pirmajā rindā nediferencēti pluripotento embrionālo cilmes šūnu pelēm sākumā 80-to gadu pagājušā gadsimta ieguva Evans un Martin, izvēloties tos no iekšējā šūnu masa no blastocistas - embryoblast. Izolētās ESC līnijas ilgstoši saglabā pluripotenci un spēj diferencēt dažādu šūnu tipus īpašas barotnes faktoru ietekmē.

Termins "embrionālo pluripotento cilmes šūnu" pieder Leroy Stevens, ka izmeklēšana par tabakas darvas ietekmi uz biežumu audzēja attīstības vērsa uzmanību uz spontānas sēklinieku teratokarcinomas lineāra (129 / v) no pelēm no kontroles grupas. Sēklinieku teratokarcinomas šūnas tika raksturīga augsta proliferācijas ātrumu, un klātbūtnē šķidruma palicis vēdera dobumā ar veidošanos spontānu diferenciācijas neironiem, keratinocītu, hondrocītu, kardiomiocītos, kā arī matu un kaulu fragmentu, bet bez jebkādas norādes par sakārtotā cytoarchitectonics piemērotos audos. Stādot teratokarcinomas šūnu kultūrā audzē brīvos uz substrāta polipotentas klonus un veidojas embryoid struktūras pēc tam tika rūdīts un pakļauti spontānu dalīšanās Nesakārtotus diferencēšanos par neironiem, glia, muskuļu šūnās un kardiomiocītos. Stevens konstatēts, ka teratokarcinomas pele 129 / v ir mazāk nekā 1% no šūnas, kas var individualizēt par dažādu specializētu somatisko līniju, un pati diferencēšana ir atkarīga no faktoriem, kas to ietekmē (sastāvu peritoneālā šķidruma, produkti pievienot kultūru nobriedušu šūnām vai audiem). Leroy Stevenson pieņēmums par klātbūtni starp teratokarcinomas šūnu embrionālā cilmes seksuālo cilmes šūnas tika apstiprināts: suspensija embryoblast Pirmsimplantācijas embriju šūnu pieaugušo peles audos veidojas teratokarcinomas, un ir atdalīta no tām tīra šūnu līnijām pēc intraperitoneālas līdz recipientam dzīvnieki tika kas sadalīta neironiem, kardiomiocītos un citu somatiskajā kletki visu trīs embriju bukletu atvasinājumi. Eksperimentos in vivo transplantācijas ESK (iegūts no embryoblast bet ne trophoblast) peļu embriju dažādās stadijās līnijas 8-32 blastomere beidzās piedzimšanas Himèriskâ dzīvnieka (nav audzējs veidošanai) orgānu kas atklāj asni donora audiem. Kimerisms tika novērots pat dzimuma šūnu līnijā.

Primary cilmes cilmes šūnas izolēta no peļu embrija cilmes dzimuma, morfoloģijas, imunoloģisku fenotips un funkcionālās īpašības, kas atbilst hESCs, kas iegūti no teratokarcinomas Stevenson un embryoblast. At himēru dzimušo pēc ievadīšanas hESCs uz Blastocistas, allofenny orgāns morphogenesis kas raksturīga mozaīkveida alternating donors un saņēmējs strukturālās un funkcionālās vienības aknu, plaušu un nieru. Vairākos gadījumos tika novērota zarnu skriptu vai aknu dobumu veidošanās, kas sastāvēja vienlaikus no saņēmēja un donoru šūnām. Tomēr ieviešana morfoģenēzes vienmēr notika par ģenētisko programmu veidā, kas piederēja saņēmējam, un himērismu ierobežoja šūnu līmenī.

Tad, tika konstatēts, ka proliferācija hESCs bez cytodifferentiation apgādes slānis-atvasināts mezenhimālajās šūnās (augļa fibroblastus) notiek klātbūtnē LIF saistošs selektīvām barotnē, kas selektīvi sniedz tikai izdzīvošanu cilmes un cilmes šūnu, savukārt lielākā daļa no specializētu šūnu elementu dies. Izmantojot šo paņēmienu 1998 James Thomson tika piešķirti pieci imortalizèto līnijas embriju cilmes šūnas no iekšējā šūnu masa no blastocistas personas. Tajā pašā gadā, Džons Gerhart ir izstrādājusi metodi izolējot nemirstīgu ESC līnijas no seksuālās dvesma 4-5 nedēļu cilvēka embrijiem. Pateicoties savām unikālajām īpašībām, tikai divus gadus vēlāk, embrija cilmes šūnām un cilmes šūnas galīgo audi ir sācis tikt izmantoti praksē reģeneratīvās medicīnas un gēnu terapiju.