Nevīrusu gēnu terapija piedāvā cerību uz hroniskām muguras sāpēm

Nesenā pētījumā, kas publicēts žurnālā Biomaterials, pētnieki izstrādāja jaunu nevīrusu gēnu terapiju, lai ārstētu diskogēnas muguras sāpes (DBP), ievadot transkripcijas faktoru Forkhead. Box F1 (FOXF1), izmantojot inženierijas ekstracelulāros pūslīšus (eEV) deģeneratīvos starpskriemeļu diskos (IVD) in vivo.

Hroniskas muguras sāpes (LBP) ir pieaugoša globāla problēma, ko izraisa sabiedrības novecošanās un opioīdu problēmu saasināšanās. Pašreizējās ārstēšanas metodes ietver īslaicīgu atvieglojumu vai dārgas operācijas, uzsverot nepieciešamību pēc atkarību neizraisošām un mazāk invazīvām terapijām.

Pašreizējās bioloģiskās terapijas, tostarp augšanas faktora ievadīšana, šūnu terapija un vīrusu gēnu terapija, var samazināt deģenerāciju dzīvnieku un cilvēku modeļos. Tomēr tādas bažas kā īslaicīga ietekme, slikta ilgtermiņa efektivitāte un nevajadzīga imunogenitāte un audzēja ģenēze var kavēt šo metožu tiešu pielietošanu.

Šajā pētījumā pētnieki izveidoja nevīrusu gēnu terapiju starpskriemeļu disku deģenerācijai (IVD), izmantojot FOXF1-eEV.

Pētnieki transfektēja primāros peles embriju fibroblastus (PMEF) ar plazmīdu, kas satur FOXF1 vai pCMV6 kā kontroli, un raksturoja eEV paraugus, izmantojot nanodaļiņu izsekošanas testu (NTA).

Viņi novērtēja molekulāro kravu efektīvu iekraušanu eEV, izmantojot kvantitatīvu reversās transkripcijas-polimerāzes ķēdes reakciju (qRT-PCR) un parasto PCR. Western blot analīze identificēja FOXF1 un specifiskus EV proteīnus eEV veidojumos. Komanda izmantoja plazmīdas, kas uzlabo augšup un lejup esošos polilinkera reģionus, lai noteiktu FOXF1 plazmīdas DNS klātbūtni donoru šūnās un radītos eEV.

Viņi pārbaudīja pilna garuma mRNS, kas iegūta no plazmīdas DNS eEV un donoru šūnās.

Pētnieki izveidoja ārpusšūnu pūslīšus ar transkripcijas faktoriem, lai atjaunotu audu darbību un mainītu sāpju reakcijas DBP dzīvnieku modelī.

Viņi identificēja EV, lai transportētu un izplatītu FOXF1 uz bojātiem starpskriemeļu diskiem diskogēno muguras sāpju peles modelī, lai noteiktu FOXF1 eEV starpskriemeļu disku deģenerācijas kavēšanu.

Komanda apvienoja peļu starpskriemeļu disku biomehānisko testēšanu ar attēlveidošanu, ekstracelulārās matricas (ECM) izmaiņām un sāpju reakciju, kas tika novērtēta pēc 12 nedēļām, lai apstiprinātu struktūras un funkcijas izmaiņas, kā arī terapeitiskās iejaukšanās izraisītās sāpes.

Pirmsoperācijas un pēcapstrādes sāpju novērtējumi ietvēra mikrodatortomogrāfiju (mikro-CT), magnētiskās rezonanses attēlveidošanu (MRI), mehāniskos testus, Alcian zilo (AB) un pikrozīrija sarkano (PSR) krāsošanu, dimetilmetilēnzilo testu un imūnhistoķīmiju (IHC). )).

Pētījumā tika izmantota ķirurģiska metode, kurā pētnieki subkutāni injicēja pelēm buprenorfīnu ER, lai kontrolētu pēcoperācijas sāpes.

Komanda veica uzvedības novērtējumus pirms operācijas un ik pēc divām nedēļām no četrām līdz divpadsmit nedēļām pēc operācijas, izmantojot dažādas metodes, piemēram, atklātā lauka testu, aukstās plāksnes, astes piekari un stieples piekari.

Atklātā lauka testā tika novērtēta peļu spontāna aktivitāte; aukstās plāksnes testi mēra termisko hiperalgēziju; Astes piekares testi mērīja aksiālās sāpes; un stiepļu balstiekārtas testos izmērīta stiprība.

Divpadsmit nedēļas pēc operācijas komanda izgrieza dzīvnieku mugurkaula jostas daļas, izmantojot augšstilba nervu un artēriju izsekošanu, lai identificētu starpskriemeļu diskus starp L4 un L5, L5 un L6 un L6 un S1 IVD. Viņi izmantoja L5/L6 IVD, lai novērtētu histoloģiju un noteiktu glikozaminoglikāna (GAG) saturu.

FOXF1 eEV ievērojami samazināja sāpju reakciju, vienlaikus atjaunojot IVD struktūru un funkcijas, tostarp uzlabojot diska augstumu, audu hidratāciju, proteoglikānu saturu un mehāniskās īpašības.

Pētījumā galvenā uzmanība tika pievērsta ar FOXF1 ielādētu eEV izdalīšanos no primārajiem fibroblastiem, kas transficēti ar FOXF1 transkripcijas faktoru. Kvantitatīvā RT PCR uzrādīja būtisku FOXF1 mRNS transkripta līmeņa un pilna garuma transkribētās FOXF1 mRNS līmeņa paaugstināšanos, salīdzinot ar šūnām, kas tika transficētas ar pCMV6.

FOXF1 eEV terapija var samazināt sāpju reakciju ar jostas diska punkcijas peles modeli līdz 12 nedēļām. Peļu mātītēm ar FOXF1 ārstētajā grupā bija ilgāks iegūšanas laiks nekā bojāto grupā, kas ilga vismaz 12 nedēļas pēc ārstēšanas.

FOXF1 eEV terapija uzlaboja hidratāciju un IVD audu augstumu ievainotiem un deģeneratīviem dzīvniekiem in vivo, vienlaikus saglabājot hidratācijas līmeni un T2 svērto IVD attēla intensitāti.

Tomēr komanda novēroja diska augstuma samazināšanos ievainotiem dzīvniekiem un dzīvniekiem, kuri tika ārstēti ar pCMV6 eEV. Pelēm, kas tika ārstētas ar FOXF1 eEV, diska augstums nesamazinājās 12 nedēļas pēc ārstēšanas. Dzimums neietekmēja funkcionālos rezultātus.

FOXF1 eEV atjaunoja bojātu un deģenerētu IVD mehānisko funkciju in vivo. Aksiālā sprieguma apstākļos ar FOXF1 eEV apstrādāti IVD uzrādīja augstāku normalizēto NZ stīvumu, salīdzinot ar bojātiem IVD.

Šļūdes apstākļos bojāti IVD uzrādīja palielinātus normalizētos šļūdes pārvietojumus, kas liecina par normalizētās šļūdes elastīgās stingrības samazināšanos.

Rezultāti liecina, ka GAG satura samazināšana bojātos IVD palielina mehānisko elastību, bet eEV terapija novērš glikozaminoglikāna zudumu un tam sekojošas mehāniskās funkcijas izmaiņas.

FOXF1 eEV izraisīja strukturālas un funkcionālas izmaiņas IVD, palielinot proteoglikānu un GAG līmeni.

Pētījuma rezultāti parādīja, ka eEV, kas pieslogoti ar attīstības transkripcijas faktoriem, var ārstēt sāpīgas locītavu slimības, piemēram, DBP, nogādājot šos transkripcijas faktorus deģeneratīvās un sāpīgās IVD locītavās.

Šī stratēģija var palīdzēt samazināt slimības izraisītās strukturālās un funkcionālās novirzes, kā arī regulēt dzimumam raksturīgās sāpju reakcijas.

Pētnieki ir arī ieteikuši izmantot attīstības transkripcijas faktorus, piemēram, FOXF1, lai pārveidotu deģeneratīvas NP šūnas proanaboliskā stāvoklī in vivo. Ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai noteiktu tā terapeitisko efektivitāti.