Viens flakons, divi mērķi: pārnēsājama CRISPR balstīta tuberkulozes diagnostika ar 100% jutību

Žurnālā “Science Advances” tika publicēts raksts par pārnēsājamu tuberkulozes testu, ko var veikt tieši no krēpām, bez sarežģīta aprīkojuma. Vienā mēģenē tiek apvienota izotermiska DNS amplifikācija un CRISPR nolasīšana; vienlaikus tiek testēti divi konservatīvi M. tuberculosis ievietojumi (IS6110 un IS1081), kā arī cilvēka gēns kā iekšējā parauga kontrole. Nelielā “aklā” testā ar klīniskajiem paraugiem tests uzrādīja 100% jutību (6/6) un 100% specifiskumu (7/7), salīdzinot ar kultūru; noteikšanas robeža ir ~69–81 CFU/ml simulētās krēpās. Rezultātu var redzēt uz papīra testa strēmeles, un reaģenti ir liofilizēti (uzglabāšana bez “aukstuma ķēdes”).

Fons

Saskaņā ar PVO datiem, 2023. gadā tuberkuloze nogalinās aptuveni 1,25 miljonus cilvēku; tuberkuloze atkal ir kļuvusi par galveno infekcijas izraisīto nāves cēloni ar aptuveni 10,8 miljoniem saslimšanas gadījumu. Tas padara pieejamu un ātru diagnostiku kritiski svarīgu, īpaši resursiem ierobežotās vidēs.

• Pašreizējie testi ir kompromiss starp precizitāti, ātrumu un cenu. "Zelta standarta" kultūra ir ļoti precīza, bet lēna; mikroskopija ir ātra, bet nejutīga; PCR platformas, piemēram, Xpert MTB/RIF Ultra, ir ievērojami jutīgākas (LOD ≈ 15,6 CFU/ml), taču tām nepieciešams dārgs aprīkojums un kārtridži, kas ierobežo aptvērumu.
• Kāpēc izotermiska metode un CRISPR? Izotermiskā RPA amplifikācija darbojas 37–42 °C temperatūrā un neprasa termociklerus — ērti “laukā”. CRISPR nolasīšana (Cas12/13) piešķir sugas specifiskumu un ļauj vizuāli noteikt sānu plūsmu (“strips”) bez sarežģītas optikas. Kopumā šis ir ceļš uz pārnēsājamiem un lētiem PVR testiem.
• Kāpēc divi MBT mērķi vienlaikus (IS6110 + IS1081). IS6110 irM. tuberculosis kompleksa daudzkopiju ieliktnis, taču dažām līnijām ir maz kopiju, un testi tikai ar IS6110 var "nedot rezultātus". Otra IS1081 ieliktņa pievienošana samazina viltus negatīvu rezultātu risku.
• Kāpēc nepieciešama iekšējā cilvēka kontrole. Elpas paraugos var būt inhibitori un "slikti" paraugi. Endogēnā cilvēka kontrole (piemēram, RNāze P/genomiskā DNS) apstiprina, ka materiāls ir atbilstošs un reakcija nav nomākta – pretējā gadījumā rezultātu nevar uzskatīt par negatīvu.
• Vienas tvertnes formāts pats par sevi ir svarīgs. Tas samazina nepieciešamo darbību skaitu, samazina piesārņojuma risku un atvieglo darbu ārpus laboratorijas. Šādas tuberkulozes ārstēšanas metodes jau ir pierādījušas savu dzīvotspēju; jaunajā darbā ideja tiek paplašināta līdz divu mērķu formātam ar iekšējām kontrolēm, kā arī tiek demonstrēta reaģentu liofilizācija un strēmelīšu lasītājs.
• Kāda ir pašreizējā raksta vērtība? Autori demonstrēja noteikšanu tieši no krēpām pēc visvienkāršākās parauga sagatavošanas, noteikšanas robežu ~70–80 CFU/ml simulētās krēpās un 100% jutību/specifiskumu nelielā, aklā klīnisko paraugu kopā — labs “tehnoloģiju demonstrācijas materiāls” turpmākām daudzcentru validācijām.

Kā tas darbojas

• Zinātnieki apvienoja RPA (ģenētiskā materiāla ātru izotermisku amplifikāciju 37 °C temperatūrā) ar "griešanas" enzīmiem Cas13a/Cas12a. Pēc vadošo RNS atlases viņi konfigurēja sistēmu, lai tā vienlaikus un paralēli cilvēka DNS mērķētu uz diviem MBT mērķiem (pārbaudot, vai paraugā vispār ir materiāls un reakcija nav "apstājusies").
• Visa ķīmija nonāk vienā mēģenē; pēc inkubācijas rezultātu nolasa vai nu ar fluorimetru, vai uz sānu plūsmas sloksnes — būtībā līdzīgi kā eksprestestā.
• Krēpu apstrāde ir vienkāršota līdz karsēšanai un īsai centrifugēšanai — bez nukleīnskābju ekstraktoriem. Visierobežotākajos apstākļos autori pat apspriež manuālas alternatīvas centrifūgai.

Ko parādīja testi

• Noteikšanas robeža: 69,0 CFU/ml (celms H37Rv) un 80,5 CFU/ml (BCG) "asās" krēpās. Netika konstatēta krusteniska reaktivitāte ar citām baktērijām/sēnītēm.
• Klīniskā vide (maskēti paraugi): 13 paraugiem no reālās prakses - 100% jutība (6/6) un 100% specifiskums (7/7) attiecībā pret sēšanu. Salīdzinājumam, tajā pašā komplektā GeneXpert Ultra uzrādīja attiecīgi 100%/86%.
• Tehniskas nianses: no abām nolasīšanas iespējām Cas13a darbojās labāk ("viena katla" formātā tas ir jutīgāks nekā Cas12a). Turklāt divu Mtb mērķu paralēla testēšana samazina kļūdainu rezultātu risku.

Kāpēc tas ir nepieciešams?

Mūsdienu testi ir kompromiss starp precizitāti, ātrumu un pieejamību: kultivēšana ir ļoti precīza, bet lēna; uztriepes ir ātras, bet neprecīzas; PCR sistēmas, piemēram, GeneXpert, ir precīzas un ātras, taču tām nepieciešami dārgi instrumenti un kasetnes. Jaunā CRISPR pieeja mērķis ir aizpildīt šo robu: lauka diagnostika, kas darbojas 37°C temperatūrā, ar papīra strēmelīšu rādījumiem un iespēju uzglabāt reaģentus bez atdzesēšanas.

Ierobežojumi un kas tālāk

Šī ir agrīna demonstrācija nelielā klīniskā komplektā — nepieciešami lieli, vairāku centru testi (tostarp HIV koinfekcijas, bērniem, ar paucibacilārām formām un dažādām MBT līnijām). Autori atsevišķi norāda, ka pašā "lauka" versijā galda centrifūga būs jāaizstāj ar pilnībā manuālu risinājumu. Taču pati arhitektūra — "divi mērķi + iekšējā kontrole" vienā mēģenē — jau ir pierādījusi savu darbspēju un nodrošina skaidru ceļu uz pilnveidošanu masveida lietošanai.

Avots: Alexandra G. Bell et al. Vienkāršots CRISPR tests tuberkulozes noteikšanai tieši no krēpām, Science Advances, tiešsaistē 2025. gada 6. augustā (11. sējums, 32. numurs). DOI: 10.1126/sciadv.adx206