Odi ar iebūvētu "ģenētisko vairogu" aptur malāriju - inficēšanās līmenis samazinās par 93%

Insekticīdu rezistences pārvarēšana: kā viena gēna modifikācija odos pašvairojas paaudzēs, praktiski novēršot malārijas pārnešanu, neapdraudot izdzīvošanu.

Nesen žurnālā Nature publicētā pētījumā zinātnieku komanda pārbaudīja, vai glutamīna 224 (Q224) alēle fibrinogēnam saistītajā proteīnā 1 (FREP1) padara Anopheles stephensi odus rezistentus pret Plasmodium infekciju, novērtēja ar šo alēli saistītās izdzīvošanas izmaksas un testēja alēļu gēnu piedziņas sistēmu, lai izplatītu šo aizsargājošo mutāciju populācijās.

Priekšnosacījumi

2023. gadā no malārijas nomira aptuveni 600 000 cilvēku, galvenokārt bērni Subsahāras Āfrikā un Dienvidāzijā. Tradicionālās kontroles metodes – moskītu tīkli, insekticīdu apstrāde, pretmalārijas līdzekļi – zaudē savu efektivitāti odu un parazītu rezistences dēļ. Gēnu piedziņas tehnoloģijas, kas izplata labvēlīgās alēles odu populācijās, piedāvā daudzsološu un ilgtspējīgu risinājumu.

FREP1 proteīns palīdz parazītiem šķērsot odu viduszarnas, bet dabiskais variants Q224 var novērst infekciju, neapdraudot odu bioloģiju. Mērķis bija pārbaudīt, vai šādu endogēnu alēli varētu droši izplatīt, lai samazinātu malārijas pārnešanu, vienlaikus saglabājot odu dzīvotspēju.

Par pētījumu

Izmantojot CRISPR/Cas9, tika izveidoti divi Anopheles stephensi celmi, kas atšķīrās tikai ar 224. aminoskābi FREP1 proteīnā: savvaļas tipa celms ar leicīnu (L224) un potenciāli aizsargājošs celms ar glutamīnu (Q224). Vadošā RNS bija vērsta uz introna reģionu 126 bp augšpus kodona, ļaujot veikt homologu rekombināciju ar fluorescējoša marķējuma (GFP vai RFP) ievietošanu.

Piemērotība tika novērtēta pēc spārnu garuma, auglības, olu izšķilšanās spējas, kūniņu izšķilšanās, pieaugušo šķilšanās un dzīves ilguma (Kaplana-Meiera izdzīvošanas analīze).

Vektoru kompetence tika noteikta, izmantojot standarta membrānas barošanu ar parazītiem Plasmodium falciparum (cilvēkiem) un Plasmodium berghei (grauzējiem), ar oocistu un sporozoitu skaitu siekalu dziedzeros.

Alēļu piedziņas sistēma ietvēra kaseti ar gRNS pret L224 un Cas9 vasa promotera kontrolē. Alēļu frekvences tika uzraudzītas, izmantojot fluorescējošas marķēšanas metodes daudzciklu eksperimentos (10 paaudzes). Genotipēšana tika veikta, izmantojot PCR, Sanger sekvencēšanu un NGS. Bajesa modelēšana novērtēja alēļu konversiju, piemērotības izmaksas un dinamiku brīvas pārošanās laikā laboratorijā.

Rezultāti

FREP1Q224 alēle neizraisīja būtiskus izdzīvošanas zudumus: spārnu garums, auglība, izšķilšanās, kūniņu veidošanās un pieaugušo īpatņu parādīšanās bija identiska FREP1L224 kontroles grupai. Nelielas atšķirības tēviņu lielumā un dzīves ilgumā neietekmēja konkurētspēju. Neapstrādātas FREP1Q224 mātītes dzīvoja tikpat ilgi kā kontroles grupa, un mātītes pēc asins barošanas uzrādīja tikai nelielu dzīves ilguma samazināšanos.

Izaicinājuma eksperimenti atklāja ievērojamu aizsardzību homozigotēm.

• Zemās P. falciparum gametocītu koncentrācijās (0,08%):
  • Infekcijas līmenis FREP1Q224 pētījumā samazinājās no 80% līdz ~30%;
  • Vidējais oocistu skaits: no 3 līdz 0;
  • Sporozoīti siekalu dziedzeros: no >4000 līdz 0.
• Pie augstākas gametocitēmijas (0,15%):
  • Vidējais oocistu skaits: no ~32 līdz
  • Arī sporozoītu skaits ievērojami samazinājās.
• P. berghei gadījumā:
  • Vidējais oocistu skaits: no 43 līdz 25;
  • Sporozoīti: no ~19 000 līdz 11 000.
• Heterozigoti (FREP1L224/Q224) nebija aizsargāti.

Gēnu piedziņas efektivitāte

• Pāru krustojumos Cas9 + gRNS L224 pārveidoja 50 līdz 86% FREP1L224 alēļu par FREP1Q224;
• Ar mātes Cas9 biežums bija augstāks;
• 2. paaudzē aizsargājošās alēles biežums sasniedza 93%;
• NHEJ labošanas ceļa kļūdu biežums bija zems (0–12%) un parasti izraisīja bojājumus.
• Šūnu populācijās ar donora un recipienta attiecību 1:3 FREP1Q224 biežums 10 paaudžu laikā palielinājās no 25% līdz >90%;
• NHEJ alēļu biežums samazinājās no 5,4% līdz

Bajesa modelēšana apstiprināja hipotēzi par augstu konversiju, zemu stabilu mutāciju biežumu un letālu sterilu mozaīkas efektu, kur WT homozigotiem ar mātes Cas9 genotipu bija somatiskas mutācijas un samazināta izdzīvošana.

Vēlākās paaudzes uzrādīja gandrīz pilnīgu P. falciparum oocistu nomākšanu (vidēji no 0 līdz 5,5), apstiprinot, ka populācija lielā mērā ir kļuvusi rezistenta pret parazītu pārnešanu.

Aizsargājošajai alēlei nebija slēptu ieguvumu vai blakusparādību, un tā izplatījās dziņa ietekmē.

Secinājumi

Pētījumā atklājās, ka, aizstājot vienu aminoskābi FREP1 proteīnā un mainot tās mantojumu, izmantojot gēnu, Anopheles stephensi varētu padarīt praktiski imūnu pret malāriju – gan cilvēkiem, gan grauzējiem –, neapdraudot odu dzīvotspēju.

Šī pieeja papildina esošos pasākumus (tīklus, insekticīdus, zāles), kuru efektivitāti samazina rezistence. Šādu sistēmu var izmantot arī, lai atjaunotu jutību pret insekticīdiem vai ieviestu citas aizsargājošas alēles.

Pirms tehnoloģijas ieviešanas ir nepieciešami stingri vides, ētikas un pārvaldības regulējumi, kā arī izplatīšanas kontroles sistēmas.