Eksperimentāls darbs pie alogēnu keratinocītu transplantācijas uz mākslīgi radītām balto žurku rētām

Vēlme izmantot šūnu potenciālu un nepieciešamība meklēt jaunas efektīvas metodes, lai uzlabotu rētu estētisko izskatu, radīja ideju mēģināt izpētīt keratinocītu transplantācijas iespēju uz rētu virsmām.

Lai pierādītu iespēju izmantot keratinocītu kultūru, lai uzlabotu izskatu rētas eksperimentālais darbs ir darīts uz balta laboratorijas žurkām, kas tika izveidotas rētu virsmu. Žurku skaļuma modelis tika iegūts mākslīgi radītu brūču sadzīšanas rezultātā mugurpusē gar mugurkaulu. Žurkām samazināt gabalu paša ādas, izmērs 2x3 cm. Pēc 2,5 mēnešu laikā pēc darbības "simulācijas rētas" žurkām tika veikts dermabrāzijas operācijas (noņemšana augšējos slāņos, izmantojot ignioperation spureklī) un transplantēto alogēniska keratinocītu, izolētas no ādas jaunām žurkām 2-4 dienas pēc piedzimšanas.

Zirgu epidermozītu izolēšana un augšana tika veikta citās tehnoloģijās Citoloģijas institūta šūnu tehnoloģijās.

Āda tika mazgā Hanks sāļu šķīdumā, kas satur 200 U / ml gentamicīna, sagriež nelielos gabalos ar platību 0,2-0,5 cm ². Ādas kubicus inkubēja 0,5% šķīdumā disaspazē līdzsvarā ar fosfātu saturošu fosfāta buferšķīdumu 37 ° C temperatūrā stundā. Tad gabali tika pārnesti uz Dulbecco fosfāta buferšķīdumu, un epidermu atdala no dermas. Epiderma pakļāva inkubācijai ar 0,125% crvpsm šķīdumu 10-15 minūtes, nepārtraukti maisot, ar ātrumu 50 rev / min, pēc kura ferments tika apturēta, pievienojot 5% liellopu embrija serumu. Vienu trešdaļu no tā izrietošo šūnu suspensijas tika izmantota tīrā veidā uz vienu no variantiem transplantācijas rētas, otrais trešais audzē vietējā bioloģiski savienojamu plēves pārklājumu "Polipor", trešais - uz Petri traukā bez pamatnes. Operation dermabrāzija iegūts rētas žurkām ar sekojošu nodošanu tām epidermotsitov žurku saskaņā ar ētera narkozē tika veikti, izmantojot kauters.

Pirmā grupa no žurku pēc dermabrasion par pulētas, mazgā ar fizioloģisko šķīdumu un žāvē virsmas sterili spurekļa uzklāti gabalus zāliena, kas tika deponēta kodēts alogēno vai žurkas epidermotsitov vircu koncentrācijā no 1,5 miljoniem šūnu 1 ml (saskaņā ar institūta Cytology). Batistovye gabali fit uz pulēta rēta, lai šūnas atrodas uz rētas virsmas. Uz augšu tika uzšūtas vairāku saišu kārtu saišķa, kas tika piesūcināta līdz rētas malām.

Daļa no iegūta šūnu suspensijas tika uzklāta Petri traukos uz sterilām Polypore plēvēm, kas sagrieztas kausu formā, bet otru - uz Petri traukiem bez plēves. Audzēšana tika veikta FAD vidē, kas sastāvēja no DMEM un F12 maisījuma proporcijā 3: 1. Papildināts ar 10% liellopu embrija serums, 5 ug / ml insulīna (Sigma), 0,5mkg / ml hidrokortizona hemisuccinate (Sigma). 10 μg / ml epidermas augšanas faktors EGF (Citurģijas institūta RAS, Sanktpēterburga). Otrā un trešā žurku grupa ar 7 indivīdiem tika lietota 6 dienas pēc pirmās. Līdz tam laikam daudzkārtu slāņi veidoja no apsēto keratinocītu suspensijas Petri trauciņās, kuras tika pārstādītas žurkām. Otro grupu pārnes uz filmas epidermozītiem, trešā grupa - ar daudzslāņu slāni bez substrāta. Pēc 7 dienām kultūru transplantē tieši uz brūces virsmas daudzuļveidīgu alogēno keratinocītu (MPALK) slāņi, kas apsēti Polypore filmām. Augšpusē filma, lai izvairītos no tā izgriešanas, tika fiksēta ar daudzslāņu marles mērci un šūtu pie žurku ādas.

Pirms pārstādīt keratinocītu trešo grupu žurkām, audzē bez substrāta, kas ražo atdalīšanu PAO no apakšas Petri trauku dispase ārstēšanai, kam spēju selektīvi pārtrauktu Dermo-epidermālā komunikācija. Saskaņā ar rīcības daudzslāņu rezervuāra dispase sagrauj savienojumu bazālo šūnu slānis apakšā Petri trauciņā un daudz mazākā mērā, tas ietekmē starpšūnu komunikāciju, kas padara to iespējams "noņemt" visu slāni. Daudzslāņu šūnu atdalīšanās no izvietojuma tika veikta šādi. No Petri trauki sajaukts transporta vidē, šūnu loksnes skaloja trīs reizes ar vidi, kas satur antibiotiku, jo īpaši - gentamicīnu (0.2 mg / ml). Daudzslāņu slāņi ielēja par 0,125% dispase šķīdumu ( «Sigma») un ievieto inkubatorā kur tie tika inkubētas pie t = 37 ° C 20-30 minūtes. Izskats balto vainaga, pīlings ap perifērijā rezervuāra - rādītājs sākuma procesa atdalot to no malām un apakšā Petri trauciņā. Dažas minūtes pēc atdalīšanas procesa sākšanas, izjaukšanas šķīdums saplūda, epitēlija slāņi tika mazgāti 2-3 reizes ar vielu. On tika piemērota virsma epidermas slāņa, sagriež pēc izmēra kauss gabals sterils bandāžu "Leith-krāsa, kas ir sašķelts atdalīts dispase veidošanos, turpmāku atslāņošanos no apakšas kauss ar lāpstiņu. Izmantojot oftalmoloģijas pinceti slāni kopā ar pārklājuma salvete" Leith-color "(Russian ) atdalījās no apakšas Petri traukā un rūpīgi nodota sagatavotās virsmas rēta. Salvetes "Lita krāsu" satur tās sastāvā un gentamicīna eksolin (kolagēna ekstraktu), kas, ja slapjš vide paliek asns nākotnē Shem sāls šķīdums uzpūstiem un kļuva par modernu brūču pārklājums, kas nodrošina labu aizsardzību no ārējas inficēšanās un ātru dziedināšanas dēļ aizsākusies mitruma ar struktūru.

Polyprop plēves un Litas krāsas salvetes tika slāņainas ar marles saišu, kas tika uzšūtas uz žurku ādas, lai noturīgāku fiksāciju. Katra žurka tika stādīta atsevišķā būrī, lai radītu optimālus apstākļus tā uzturēšanai un transplantēto keratinocītu iegremdēšanai. Pārsēji žurkām, ka katru dienu transplantē apturēšanu un daudzslāņu rezervuārs epidermotsitov shot dispase, vairākas reizes dienā, samitrina ar sterilu fizioloģisko šķīdumu, lai radītu vislabvēlīgākos apstākļus šūnas uz iemājošanai. Ņemot vērā to, ka filma "Polypor" bija ūdens necaurlaidīga, otrās grupas žurkas nemitināja sajaukumus, kas bija viena no priekšrocībām salīdzinājumā ar transplantātiem bez plēvēm. Pēc 10 dienām saiti tika noņemti. Raugu klīniskā izpausme pēc šūnu transplantācijas nedaudz atšķīrās no rētas bez transplantācijas, izņemot rozā krāsojumu (dermabrasijas dēļ) un lielāku pīlingu. Šis fakts liek domāt, ka. Ka tūlīt pēc brūču seguma izzušanas ar IPC spermas pārmaiņas nav notikušas.

Biopsijas materiāla ņemšana žurkām.

Pēc 1, 2, 5 un 9 mēnešus pēc transplantācijas keratinocītu par žurku allogichnyh zemes rētas baltās žurkas, ņemot ražots materiāls Histoloģiskai, cytomorphological un elektronu mikroskopiskā pētījumā. Kā kontrolparaugus no normālas žurkas ādas un rētas tika ņemti bez šūnu transplantācijas. Anestēzija žurkām tika veikta ar ētera anestēziju.

Pēc anestēzijas, no iezīmētajiem apgabaliem, kuros keratinocīti tika pārstādīti, tika izveidots biopsijas caurums ar diametru 2 mm. Raugu audu gabali tika ņemti un ievietoti 2,5% glutāraldehīda šķīdumā, lai sagatavotu materiālu elektronu mikroskopijai. Audu gabalus, kas veikti, lai histoloģiskai izmeklēšanai tika ievietoti 10% neitrālā formalīna šķīdumā, kam seko ar elektroinstalācijas spirtu un aizpilda parafīns, sekoja pārgriežot ultrathin sadaļām un skatot tos gaismas optisko mikroskopu.

Kontrole I. Normāla žurkas āda.

Lai redzētu atšķirību starp normālu rētu izmainītu žurku ādas un rētu mikroskopisko attēlu noteiktos laikos pēc IPK transplantācijas, tiek uzrādīti fotoattēli un apraksti uz tiem visos šī pētījuma posmos.

Parastās ādas epiderma sastāv no 7-9 šūnu slāņiem. Ragains slānis vidēja biezuma. Vietās tas sastāv no 6-8 slānis ragveida svari. Bāzes slāni pārstāv cilindriskas formas šūnas ar lielu gaismu, regulārus kodus un vairākas nukleoles. Desmosomāli savienojumi starp šūnām un bazālo membrānu ir skaidri izteikti. Saskaņā ar labi definēta bazālo membrānu, kas ir naudas izciļņi, kas subepidermal slāņa melu paralēli maigu saišķu kolagēna un elastīna šķiedru, ieskaitot iegarenas fibroblastos, maziem kuģiem. Dziļākos slāņos kolagēna un elastīna šķiedru kūļi atrodas dažādos virzienos. Starp tiem ir daudzi trauki ar tāda paša kalibra plānām sienām, šūnu elementi (fibroblasti, mastobas, leikocīti). Daudzos matu folikulās ir tauku dziedzeri.

Kontrole 2. Žurka 2 mēnešus veci.

Klīniskais attēls. Rētas gaiši rozā, ar pīlingu, vietās, kur konservi paliek. To platība ir samazinājusies, jo kontrakcijas kolagēna šķiedru un kļūst apmēram 3,0-3,5 cm ^:. Ādas stiprinājumi nav.

Mikroskopiskais attēls. Epidermu sastāv no 3-5 slāņu šūnu, kroku, ko pārstāv noapaļotiem bazālo šūnu, viens rindā subulate, 1-2 rindas keratohyalin granulu ar graudiem augšējā slānī, ir porcijas intracelulāras tūskas. Ragēna slānis ir neviendabīgi mainīts no ļoti plānas līdz sabiezētām. Rauga audu (kontrakcijas) dēļ ir spazmas locītava. Frēzijas iekļūst papilāru slānī un rada papiljonu iespaidu. Robeža starp epidermu un dermu ir taisna līnija. Bāzes membrānu nevar izsekot visur. Apakšpītermisko un dziļāko slāņu apakšējā daļā - kuģi ar biezu, atšķaidītu sienu, daudzi pametis, ar stāsas fenomeniem. Apkārt kuģiem - makrofāgu kopums, fibroblasti. Makrofāgi ieskauj eritrocītus, kas rodas no kapilāriem, un tos fagocīti. Jo vairāk virspusējos slāņos - mazie kapilāri. Zem epidermas kolagēna šķiedras ir brīvas. Spure dziļākajā slānī ir rupji kolagēna šķiedru kūlīši, starp kuriem ir daudz fibroblastu.

Žurku kauliņš mēnesi pēc MPAl žurku kauliņu keratinocītu transplantācijas.

Klīniskais attēls. Rētas rozā, to platība ir samazināta, jo īpaši diametrā, ar vidēji 2,5-3 cm ². Nav matu un tauku dziedzeru.

Tie mikroskopu no materiāliem, kas iegūti no žurkām ar transfer MPAlK MPAlK par filmu un substrātu bez būtībā identiski. Tomēr tehniski, darbs ar MPAlK neatbalstīts daudz grūtāk un darbietilpīgs, nekā tad, kad audzētas MPAlK uz pamatnes, tā turpināt pētīt šo jautājumu par transplantāta kertainotsitov rētas mēs izmantot kā pamatu audzēšanai ( "substrāta") kārtains zāliena.

Mikroskopiskais attēls. Epidermas sabiezējums ir 15-20 slāņi, gandrīz līdz vidum keratinocīti ir šauri, iegareni, vertikāli un kompakti. Bāzes šūnas ir novietotas nelīdzena līnijā. Viņu kodi ir viegli, lieli, apaļas formas ar vienu vai diviem nukleoliem, kas norāda uz to augstu sintētisko un proliferatīvo aktivitāti. Robeža starp epidermu un dermu ir taisna līnija. Tievs slānis ir labi attīstīts, sastāv no 3-5 šūnas apaļas formas šūnas, ir 2 nucleolus šūnas.

Tūlīt zem pamatnes membrānas - blīvi izvietoti plānas kolagēna šķiedru kūlīši, paralēli tām ir liels skaits tukšo trauku, dziļākas kolagēna šķiedras ir rupji, savāktas blīvās saišķos. Daudzi lieli fibroblasti, mastlīnijas (2-3 redzes laukā), makrofāgi, leikocīti un tukši trauki, kuru sienas ir atbrīvojušās, ap tām ir brīvi izvietotas kolagēna šķiedras. Dažos kuģos - stāze, vienveidīgu elementu diapedēze. Ap asinsvadu - fibroblasti, atsevišķi limfocīti. Ādas stiprinājumi nav.

Kad keratinocītu suspensija tiek pārstādīta uz pulēta rēta, mikroskopiskais attēls atšķiras no iepriekšējā. Lielākajā daļā dzīvnieku - epiderma ir plāns, sastāv no 5-6 šūnu slāņiem. Apakšējais slānis sastāv no neregulāras, daudzstūra formas šūnām ar noapaļotiem neregulāras formas kodoliem. Subepidermālā slāņa stāvoklis ir tāds pats kā dzīvniekiem bez transplantācijas.

Šajā gadījumā var runāt vai nu par kavēšanos procesos, kas saistīti ar šūnu transplantāciju, vai arī par lielu šūnu zudumu, kas pārstādīti suspensijas veidā. Tādēļ tika secināts, ka rētu korekcija keratinocītu transplantācijas veidā suspensijas veidā nav piemērota.

Žurkas rētas 2 mēnešus pēc MPAl žurku žurku keratinocītu transplantācijas.

Klīniskais attēls. Raugs izskatās plāns, maigs. Vietās ir eksdizas, svari.

Mikroskopiskie attēli. Raugļu slānis ir sabiezējis, vietās - hiperkeratoze. Epiderms ir sabiezējis, tas sastāv no 12-20 rindām šūnu. Robeža starp epidermu un dermu ir taisna līnija. Gludas kolagēnas šķiedras zem epidermas atrodas diezgan stingri. Cilvēka dziļākajos slāņos tie tiek savākti rupjās lielās saišķos. Subepidermālā slānī parādās jauna kuģu veidošanās. Rudu audu apakšējos slāņos - daudzi tukši trauki, kas atrodas paralēli epidermas virsmai. Lieli fibroblasti ir vienmērīgi sadalīti burbuļa biezumā, tur ir milzīgs, daudzšķautņains, daudzi makrofāgi.

Žurkas rētas 5 mēnešus pēc žurku spermocītu MP transplantācijas.

Klīniskais attēls. Rēta izskatās gluda, gluda, bez pīlings ir viena mati to lielāku blīvumu perifērijā rētas, kas norāda uz malu ieaugušu matu folikuliem spureklī un jaunveidojumu no matu folikulu. Raugu laukums turpina samazināties.

Mikroskopiskais attēls. Epidermas biezums (15-20 slāņi, reizēm līdz 30) augšējos slāņos ir piepildīts ar keratogialīna graudiem. Balasta membrāna ir skaidri redzama. Zem viņas kolagēna šķiedrām paliek vaļā. Zemākajos slāņos - kolagēns ir spēcīgāks un cieši noslēgts. Starp kolagēna sijām ir daudzi kapilāri .. Augšējā slāņos samazinājies tukšo kuģu skaits. Epidermas un dermas ir nedaudz viļņotas. Rauga audos ir dziļi epidermas izaugumi. Starp kolagēna šķiedrām ir redzami jaunizveidotie trauki. Parādiet vienu matu folikulu un tauku dziedzeru.

Žurkas rētas 9 mēnešus pēc IPA žurku žurku epidermozītu transplantācijas.

Klīniskais attēls. Rētas ir kļuvušas daudz mazākas salīdzinājumā ar iepriekšējiem terminiem, to platība vidēji ir aptuveni 1,5-2,0 cm ². Rētas ir nevienmērīgi pārklātas ar plāniem matiem, it īpaši ap perifēriju. Saglabā nelielu plākšņu mērogu.

Mikroskopiskais attēls.

Epiderms kļuva plānāks, attēlots no 6-8 rindu šūnām, kas atgādina normālu ādas žurku epidermas struktūru, tikai šūnu blīvums ir 1 mm. Lielāki un tie ir mazāki. Bāzes slānis sastāv no nelielām šūnām ar apaļo cilindrisko formu. Bāzes membrāna ir labi definēta, hemidesmosomes ir skaidri redzamas. Tiek atzīmēts epidermisko izaugumu klātbūtne subepidermālā slānī. Papilāru slānis ir izteikts visā rētas garumā. Šie fakti liecina, ka šajā laika posmā transplantēto keratinocītu saķere ar ievērojamiem spp. Audiem ir kļuvusi ievērojami stiprāka. Tādējādi tradicionāli var būt rūpēties par cilvēku, kuriem ir MALC transplantācija, rētas 9 mēnešus pēc IPK transplantācijas. Zem epidermas ir smalka kolagēna šķiedra nekā dziļajos slāņos. Bija daudzi kuģi, jo īpaši virs zemes. Lielākos traukos sienas ir sabiezinātas. Matu folikulas un tauku dziedzeri lielos daudzumos. Mikroskopiskais modelis atgādina ādas audus.

Eksperimentālā darba rezultāti un to apspriešana.

šo darbu par mākslīgo ādas rētu žurkām pēc darbības dermabrāzijas, pārstādīto keratinocītiem dažādi formah- uz brūces virsmu, suspensijas veidā, batists un slāņveida veidošanās bez pamatnes laikā. Darbs tika veikts, lai iegūtu morfoloģiskos datus par transplantēto alogēno keratinocītu ietekmi uz rētām, kā arī optimālu transplantācijas variantu noteikšanu.

Tika konstatēts, ka visas trīs transplantācijas metodes ir reālas, bet IPAA transplantācija bez substrāta ir ļoti darbietilpīga procedūra, kuras laikā IPAC var tikt ievainots, un tas ietekmē transplantācijas rezultātus. Turklāt šī transplantācijas metode izslēdz darbu pie lielām virsmām.

Transplantācija keratinocītu balstiekārta - ir ievērojami ekonomiskāks metode neprasa ilgu kultivēšanu šūnu un vienkāršs šajā iemiesojumā, kontaktu, izmantojot sterilu batists sagataves, kuru izmēri atbilst vērtībai rētas. Terapeitiskā efekta novēlošanās laikā šūnu suspensijas transplantācijas apmēram mēnesi, salīdzinot ar MIC uz brūču pārklājuma, nav nozīmīgs moments ar ārstēšanas ilgumu, kas tiek aprēķināts daudzus mēnešus. Ir zināms, ka IPC transplantācijas laikā, lai sadedzinātu pacientus, ādas struktūras stāvokļa pārveide notiek pakāpeniski un vairākus gadus. Keratinocītu kultūras pārnešana uz brūču segumiem ir ērtākā un daudzsološākā metode, tomēr tā ir arī daudz dārgāka. Papildus tam, šodien prasa, lai sarežģītāki pārklājumi būtu plastikāta, higroskopiski, bakteriostatiskie vai baktericīdie, un šūnām jābūt bioloģiski neitrāliem. Filma "Polipor" - starpprodukts versija iekšzemes filmu brūces segumu, neskatoties uz dažiem trūkumiem, ļāva mums mācīties eksperimentāli keratinocītu transplantācijas žurkām uz rētas un izdarīt secinājumus par efektivitāti šajā virzienā piesaistes rētas.

Autori, kuri veic transplantācijas uz IPC brūcēm sadedzināta, norādīja, ka pirmajā nedēļā pēc transplantācijas ar daudzslāņu rezervuāra keratinocītu pie brūci dezinficē epidermas sabiezē un stratificēta. Visi epidermas slāņi bija labi definēti. Interesanti, ka transplantātu šūnu skaits ir par 10-30% lielāks nekā ādas biopsijas paraugos. Autori atzīmēja keratogialīna granulu parādīšanos 5. Dienā pēc MPA transplantācijas, bazālās membrānas un hemīdsemosomu jau trešajā dienā.

J.Rives et al. (L994), Paramonov BA (1996); NM Kuzņecova et al. (1998) konstatēts, ka laikā agrīnās periodos pēc transplantācijas BMD pacientus ar polnosloynymi ādas defektu pēc apdegumiem, komunikācija starp dermas un epidermas ir ļoti vāja un ir taisna līnija, papillārā slānis ir klāt. Otrajā mēnesī sākas sekla sejas papilomas un ādas piedēkļu veidošanās, savienojums starp dermu un epidermu kļūst izturīgāks. Kā daudzsološa metode literatūras dati attiecas uz alogēno keratinocītu transplantāciju uz sadedzināto pacientu brūču. Neskatoties uz to, ka noraidījums allogēniem keratinocītu notiek iesniegto dažādu autoru laikposmā no 10 dienām līdz 3 mēnešiem, tomēr viņiem ir loma sadzīšana brūces virsmas, atbrīvojot augšanas faktorus un mehāniski aizvērt defektu. Tiek uzskatīts, ka MPALK ir samazināta antigēna aktivitāte, jo audzēšanas laikā in vitro zaudē Langerhans šūnas, kas ļauj tiem ilgstoši eksistēt recipienta organismā. Turklāt alogēno kultūru, kas iegūta no jauno veselīgu cilvēku ādas, ir nesamērīgi lielāks bioloģiskais potenciāls nekā pacientu autologā kultūra pēc traumas.

Mūsu pētījuma galvenais mērķis bija noskaidrot, vai alogēnas keratinocītes izdzīvos rētas un kādas būs izmaiņas rēta audos šāda bioloģiski aktīva "brūču pārklājuma" ietekmē. Ja ir pozitīvs rezultāts, šajā rehabilitācijas medicīnas jomā jāizstrādā visefektīvākās un mazāk darbietilpīgās tehnoloģijas.

Daudzos aspektos iegūtie dati izrādījās līdzīgi literatūras datiem par cilvēka epidermas morfoloģiskajām izmaiņām pēc alogēno keratinocītu pārnešanas, lai sadedzinātu brūces. Bet pastāv ievērojamas atšķirības gan attiecībā uz morfoloģisko substrātu, kas tiek pārstādīts, gan tehnoloģijas ziņā. Tātad veidošanās bazālo membrānu un caur ādu-epidermālā zīmju (poludesmosom, kārpaina) notiek vēlāk, salīdzinot ar keratinocītu pārnesei brūce virsmām bez rētas. Šķiet, ka tas ir saistīts ar slikta mutes dobuma audu barošanu, salīdzinot ar dermu vai muskuļu fasādi. Raksts, it īpaši vecais, ir blīvs saistaudiņš ar ļoti mazu daudzumu trauku, apdeguma brūces dibens ir granulācijas materiāls, kas bagāts ar asinsvadiem. Tādējādi ir acīmredzams, ka apstākļi, kādos notiek keratinocītu transplantācija un iegremdēšana, ir pilnīgi atšķirīgi. Jo vairāk vaskularizēta šūnu transplantācijas zona, jo vieglāk to apstrādāt. No šī postulāta ir secinājums par priekšroku darbam ar jaunām rētām, kurās saistaudi joprojām ir pietiekami brīvi un bagāti ar asinsvadiem.

Šī eksperimentālā darba rezultātā tiek pierādīts, ka:

1. Iespējama MALK transplantācija pret rētām. 
2. Optimāla transplantācijas metode ir keratinocītu transplantācija uz brūces pārsega.
3. Rētas virsma ir jānotīra, izmantojot operatīvu dermabrāziju, izmantojot Schumann lāzeru vai griezēju.
4. MPALK ietekmē parādās burzmaņa virsmas epitēlija.
5. Jo labāks vaskularizēts rētaudiņš, tas ir, jo jaunāks ir rēta, jo labāk keratinocītu transplantācija.
6. Rētaudi transplantēto keratinocītu ietekmē pamazām pārveidojas un pārvēršas par ādu (vairāk mīkstu rētaudu ar ādu).
7. Pakāpeniska rētas audu atslāņošanās sākas ar subepidermālā slānī. Uzlabo vaskulāzarizāciju, kolagēna šķiedru kūlīši spermas augšdaļā un apakšdaļā aizņem vairāk trauslu vietu nekā rētas audos bez šūnu transplantācijas. Ir matu folikulas un tauku dziedzeri. Epidermas struktūra pēc hipertrofijas fāzes pārejas tuvojas normālai ādas epidermijai.
8. Novērotās izmaiņas ir saistītas ar keratinocītu izdala augšanas faktori, citokīni, kas uzlabo trofiku rētaudi sekmē tās pārveidošanu no stīva šķiedrveida audu brīvāku, kas noved pie uzlabojumiem rētas.

Tādējādi, pamatojoties uz šo pētījumu, var secināt, ka transplantēto keratinocītu labvēlīgā ietekme uz rētaudu, kas var būt praktiski nozīmīga pacientu ar dažāda veida rētu rehabilitācijai.

Šis darbs ar žurkām ļāva formulēt prasības. Uz brūču segumiem, kuros audzē keratinocītus.

Brūču segumiem jābūt:

• bioloģiski saderīgs ar šūnām,
• elpojošs
• ir elastīga, formas veidošanas pamatne,
• būt hidrofils,
• jo zāļu piedevas satur antibakteriālas zāles un antioksidanti nav toksiski kultivētām šūnām.

Raugu biotehnoloģiskās ārstēšanas klīniskie rezultāti.

Agrāk N. Carvers un citi. (1993) konstatēja, ka oklizējošās pārsēji vislabāk ir saistīt ar keratinocītu ievainojumu un izdzīvošanu, bet neļauj veidoties stratificētai (nobriedušai) epidermai. Lai veidotu stratificētu epidermu, nepieciešama gaisa vide. Tāpēc pēc daudzslāņu slāņa piestiprināšanas pēc 7-10 gadiem tika ieteikts oklizējošs brūču pārklājums, lai noņemtu un veiktu brūces ar sausām bandažām vai ūdenī šķīstošām ziedēm. Mēs varam teikt, ka kvalitāte un īpašības no "substrāts", uz kuru tiek audzēti šūnas ir ļoti svarīgs brīdis efektivitātes transplantācija šūnu materiāla, un līdz ar to attiecībā uz darba ārstu rezultātiem. Bet ideāls bandāžu šodien nav, neskatoties uz pārpilnība ierosinātajiem variantiem (mākslīgās ādas, neausta auduma karboksimetilcelulozes, fibrīna pārklājumu, daļēji caurlaidīga poliuretāna plēve). Šajā jautājumā ne mazsvarīgākais moments ir "substrātu" (īpašu brūču pārklājumu) izmaksas, jo to augstās izmaksas palielina kopējās biotehnoloģiskās apstrādes izmaksas.

Mobilo tehnoloģiju efektivitāte ir pierādīta līdz šim, taču, diemžēl, šīs tehnoloģijas ir ļoti dārgas, īpaši valstīs, kurās nav izveidota šūnu kompozīciju rūpnieciskā ražošana. Tomēr tādas valstis kā Amerikas Savienotās Valstis jau sen ir izveidojušas rūpniecību, lai ražotu šūnu materiālu sadedzinātai transplantācijai. Proti, uzņēmums BioSurface Technology Inc, kopš 1989. Gada, izvirzīja 37.000 lamināta slāņi keratinocītiem, kas ir izmantoti, lai ārstētu 240 pacientiem 79 valstīs visā pasaulē (R.Odessey, 1992) ar 1 cm ² šūnu kultūrā izmaksas par 7-8 ASV dolāri

Dažādu slimību un ādas problēmu ārstēšanas tehnoloģijai ir vairākas atšķirības, bet jebkuras šūnu ārstēšanas pamatā ir kvalitatīvu šūnu materiāla ražošana un transplantācija.

Šis process sastāv no šādām darbībām:

• ādas izvēle no ietekmētā (vai no donoriem),
• ādas atlaižu transportēšana uz biotehnoloģijas centru,
• bazālā slāņa šūnu izolēšana un to pavairošana,
• daudzslāņu keratinocītu (IPC) slāņu uzkrāšanās.
• šūnu kultūru transplantācija.

Galvenā problēma ārstēšanā ar daudzslāņu keratinocītu slāņu transplantāciju ir dzīvotspējīgu šūnu nepieciešamība visos šūnu transplantācijas posmos. Ādas gabaliņi, lai izolētu autologās vai alogēnas šūnas, būtu pēc iespējas plānāki, jo šajā gadījumā tos vieglāk atdalīt, izmantojot mehāniskās un fermentatīvās metodes, un iegūt dzīvu šūnu suspensiju izaugsmei. Tos var iegūt, nogriežot dermatomu vai izmantojot acu plakstiņu ādu, priekšādas daļu, pleca iekšējo virsmu. Ņemot vērā, ka šūnas ir jutīgas pret halogēniem (hlors, jods), ūdeņraža peroksīdu, tos nevar izmantot ādas ārstēšanai materiāla ņemšanas brīdī.

Kvantitatīvā un kvalitatīvā šūnu peļņa no ādas potzariem un to audzēšanas efektivitāte ir atkarīga arī no donora veselības stāvokļa un vecuma. Turklāt ādas biopsijas paraugi pēc iespējas ātrāk un atbilstošos apstākļos (apkārtējā vidē, temperatūrā) jānodod laboratorijai, kas nogādāta sertificētā un akreditētā laboratorijā.

Uzglabāšanai un transportēšanai ādas potzarus var lietot vai Dulbecco Medium 199 papildināts ar 10% liellopu seruma, vidējā DMEM papildināts ar 5% liellopu embrija serumu un antibiotikām.

Citoloģijas laboratorijā ādas biopsija vispirms tiek mehāniski sadalīta mazos gabalos, tad ādas fragmentu apstrādi veic ar fermentu palīdzību: tripsīnu, kolagēziātu, dispazi utt.

Saskaņā ar enzīmu iedarbību notiek desmomasu iznīcināšana, un keratinocīti tiek izvadīti vidē kā atsevišķas šūnas vai pildvielas, kas sastāv no dažādiem šūnu skaita. Attiecībā uz kultūru tiek izmantoti tikai bazālie keratinocīti, kurus audzē īpašā barotnē inkubatoros, kuros ir 5% CO, Petri trauciņos vai flakonos pie t = 37 ° C. 48 stundu laikā tiek novērota keratinocītu koloniju veidošanās, kas pakāpeniski saplūst monolos. Pēc tam, kad ir iegūts pietiekams skaits šūnu, iegūto suspensiju izlīdzina uz šim nolūkam sagatavotiem brūču pārklājumiem un ievieto Petri traukos. No suspensijas, vispirms izveido monolīšu un pēc tam daudzslāņu keratinocītu slāni. Shematiski, keratinocītu audzēšanas procesa posmi ir parādīti attēlā. 12 (33.43.54.65).

Transplantācijai piemērotas daudzslāņu keratinocītu veidošanās veidošanās parasti ilgst 7-10 dienas. Dažreiz šis periods ir garāks, un tas ir atkarīgs no izejmateriāla kvalitātes (vecums, līdzekļu devēju veselība, materiāla pareizība, izmantotā materiāla kvalitāte utt.). Ja daudzslāņainais slānis pārspēj, tad uz tā virsmas var būt šūnas ar apoptozes fenomenu, kas nav piemēroti transplantācijai. Petri trauciņi, audzēti ar viņiem brūču slāņiem daudzslāņu pārklājumu keratinocītu (IPC) tiek piegādāti klīnikā īpašos konteineros temperatūrā, kas nav zemāka par + 15 ° C

Modificētā Zaļā metode IPK audzēšanai

Mūsu darbā kā brūces pārklājums mēs izmantojām daudzslāņainu kembriku, atsakoties no polipora filmas, ar kurām mēs sākām strādāt eksperimentā ar žurkām. Tātad, daudzslāņu keratinocītu slāņi tika audzēti ar pretauku un sterilu batistu, lai gan tas arī nav optimāls brūču pārklājums.

Klīniskie pētījumi tika veikti brīvprātīgajiem, ievērojot nepieciešamās ētikas normas: līguma parakstīšana un informēta piekrišana.

1. Tika izmantota pašu (autologo) kultūra un ņemti no banku šūnām (alogēnas) keratinocīti.
2. Paši keratinocīti iegūti no ādas gabala, kas noņemta no pacienta pleca iekšpuses.
3. Raugu dermabrazijas operācija tika veikta ar termoapstrādes, rotācijas disku un erbija lāzera palīdzību.
4. Pacienti saņēma normotrofiskas, hipotrofiskas un hipertrofiskas rētas.

Tehnoloģiskais process mobilo tehnoloģiju pielietošanai, lai uzlabotu ādas rētu veidus, sastāvēja no šādiem posmiem:

1. Pacientu izvēle.
2. Izskaidrojiet ārstēšanas būtību, gaidīto rezultātu iegūšanas laiku, līguma parakstīšanu un informētu piekrišanu.
3. Pacientu iecelšana 2-3 nedēļas pirms operācijas selmevit ar 1t. 3 reizes dienā, zinkterāls 1 t. 3 reizes dienā.
4. Ādas gabala ņemšana no 2,0 cm garas un 0,7-1,0 cm platas no pleca iekšējās virsmas, augsta, gandrīz apakšā apakšstilba apakšējā daļā, lai iegūtu autologus keratinocītus.
5. Gadījumā, ja neizdodas pacientiem uz savu izvēli keratinocītu sakarā ar iespēju iegūt lineāru rēta uz iekšējās virsmas pleca, šūnu materiāls tika ņemts no bankas šūnu (alogēniska keratinocītu).
6. Keratinocīti tika izolēti un audzēti laboratorijas apstākļos, kas sertificēti šim darba veidam.
7. Pēc IPK saņemšanas, kas bija pietiekama transplantācijai, klīnikā tika veikta ķirurģiska operācijas diena, kur materiālu ieveda īpašos traukos Petri traukos.
8. Dermabrāzijas operācija veikta atgremotāja hemostāzi zemes virsmu tika mazgāti ar sterilu fizioloģisko šķīdumu, žāvēti, pēc kā tas pārstādīti sterilos IPC batists "šūnas uz leju." Tas nozīmē, ka MIC augšdaļā esošās šūnas bija zemākas, blakus slīpi virsmai.
9. Uz augšas uzklāta sterila plēve, kas uz ādas piestiprināta ar elastīgu saiti vai Omnifix elastīgo joslu palīdzību. Filmas vietā var izmantot indifferent brūču pārklājumus, kas satur silikonu, piemēram, Mepitel, Mepiform, silikona gēla plāksnes.

Pēc 5-7 dienām filmu vai silikona pārklājumu noņem. Līdz tam laikam visiem keratinocītiem ir jāpārplūst uz pulēta rēta un jāpiestiprina pie tās virsmas.

10. Ar šo filtru un silikona pārklājumu izveidotā mitrā vide ir aktīvs. Baptistu, kas paliek uz vēdera no šī punkta, var impregnēt ar ciurozes vai hitozāna gēlu. Rezultātā 2. Dienā izveido blīvu garožu, kas pacienta ērtībai ir labāk salabot ar elastīgu, gaisu caurlaidīgu apmetumu, piemēram, Omnifix. Elpojošais garoziņš ļauj jaunizveidotajai epidermai atšķirt un kļūt par nobriedušu.

Atkarībā no rēta veida un slīpēšanas dziļuma, mērci noraida pēc 8-10 dienām. Epidermas šajā laikā ir 30-40% vairāk šūnu slāņu nekā normālā ādā. Bāzes membrāna nav izveidota. Sātinātās epidermas keratinocīti atbrīvo bioloģiski aktīvu molekulu masu rētaudos.

Raugu biotehnoloģiskās ārstēšanas panākumi lielā mērā ir atkarīgi no tā, kā viņi tiek ārstēti pēcoperācijas periodā. Šūnu kultūras ir "smalkas" veida brūču pārklājums un agrīnā periodā pēc transplantācijas, BMD var viegli atdalīties no pamatā esošajiem audiem. Tādēļ pacientiem ieteicams rūpēties par rētu pēc operācijas. 8-9 mēnešus nelieciet un viegli strādājiet ar aukstu vārītu ūdeni, lai izvairītos no plāna, tikko izveidotas epidermas izgriešanas, kurai nav stingras saķeres ar pamatā esošajiem audiem.

Piezīme.

Pirms operācijas un dermabrāzijas izmantošanu halogenēto oksidantu un konservantu (yodopiron, sulyodopiron, iodinol, yodinat, hlorheksidīnu, ūdeņraža peroksīds) laikā ir pieļaujams pirms pārstādīt kletok- absolūti kontrindicēta to citotoksisko iedarbību. Toksiska arī šūnām ir arī metilēnzils. Izcili zaļš.

Lai izvairītos no infekcijas, it īpaši, strādājot ar hipertrofiskām rētām, darbības lauks var tikt apstrādāts ar neomicīna sulfātu, polimiksīnu vai gentamicīnu. Tie nerada citotoksisku iedarbību uz keratinocītiem.

Šīs apstrādes rezultātā tiek sasniegts trīskāršs efekts.

1. Spureņa virsmas izlīdzināšana.
2. Augšā virs slānī izveidojiet jaunu epidermu, normālu biezumu.
3. Conversion of rētaudu in dermopodobnuyu, iedarbojoties ar citokīniem, augšanas faktoriem un citu bioaktīvo molekulu, ko izdala pārstādīto šūnās un keratinocītu stimulēs tiem, fibroblastu un makrofāgu.

Raksts kļūst mazāk pamanāms, elastīgāks, tajā parādās poras, mīkstinoši mati, pigmentācija var tikt atjaunota melanocītu klātbūtnes dēļ MPC.

Tomēr visi šie pozitīvie momenti rūsas laikā nenāk nekavējoties. Šajā sakarā ir jābrīdina pacienti. Ka rētas audu transformācija dermā ir lēna, un šādas ārstēšanas optimālo rezultātu var sagaidīt ne agrāk kā 10-14 mēnešus. Tūlīt pēc mērces noraidīšanas, pulētajām virsmām ir izteikts polohroms, jo spožāks ir slīpēšanas process. Vismazāk kaitējums ādai rodas normotrofisku rētu sasmalcināšanā ar erbija lāzeru. Raugu un apkārtējās ādas krāsa tika atjaunota periodā no 3 līdz 8 nedēļām. Neskatoties uz šādiem piesardzības pasākumiem, dažreiz notiek pēcoperācijas hiperpigmentācija, kas var turpināties neatkarīgi vairākus mēnešus.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]